-20℃避光

1.长期不用可以-20℃保存。
2.染色液Calcein AM注意防潮；避免反复冻融。
3.染色液A为DMSO溶液，冬季气温较低时在室温时为凝固状态，极易粘附在管壁、吸头壁。注意需要加热溶解，吸头也需要放在培养箱预热，否者容易再次凝固在吸头内壁产生损耗。融解后离心至管底部再打开螺旋盖。
4.注意需要加热融解，变成液体状态后离心至管底部再开盖。可以用手捂住使其融解或37℃短时间水浴。
5.试剂B溶解后需要用吸头吹打混匀。
6.试剂拆封后请尽快使用完！

1年

1.流式细胞仪
2.激光共聚焦
3.荧光显微镜

1.悬浮细胞
2.贴壁细胞

1.流式细胞仪
2.激光共聚焦
3.荧光显微镜

1.PBS 缓冲液（pH7.4，实验室常用的10mM磷酸缓冲盐溶液（1X））
2.或者HBSS（Hank's Balanced Salt Solution）

1.离心管
2.吸头
3.一次性手套

1.螺旋盖微量试剂管装的试剂在开盖前请短暂离心，将盖内壁上的液体收集至管底，避免开盖时液体洒落。
2.染色液A为DMSO溶液，冬季气温较低时在室温时为凝固状态，极易粘附在管壁、吸头壁。注意需要加热溶解，吸头也需要放在培养箱预热，否者容易再次凝固在吸头内壁产生损耗。融解后离心至管底部再打开螺旋盖。
3.微量试剂A为了便于观察防止误操作导致损失，在试剂盒中时是采用透明管包装，收到后可以离心移入干燥黑色避光密封管或者用铝箔包裹避光。
4. 细胞处理需要小心操作,尽量避免人为的损伤细胞。
5.由于Calcein-AM的工作液稳定性比较差，染色工作液必须现配现用，并且在当天用完。
6.Calcein-AM对湿度非常敏感，若是Calcein-AM溶液每次取完需要量后，必须紧紧密封盖子。建议根据单次用量，分装密封保存。不可使用含水的吸头。
7.试剂A母液请拧紧螺旋盖，避免受潮失效。

染色工作液的配制：
根据样品数按下列比例配制染色工作液。
用染料稀释液试剂C将染色液A和B分别10倍稀释。
每1ml HBSS缓冲液或无血清培养基中加入10μl稀释过的染色液A，充分混匀，即成染色工作液A。
每1ml HBSS缓冲液或无血清培养基中加入5-50μl稀释过的染色液B，充分混匀，即成染色工作液B。

荧光显微镜观察：
1. 准备样本细胞。
2. 用PBS洗涤细胞2-3次。
3. 用100-150μl染色工作液A至盖玻片将细胞样品覆盖（或重悬）。
4. 在室温或37℃避光孵育20-45分钟。
5. 用PBS洗涤细胞。
6. 用100-150μl染色工作液B至盖玻片将细胞覆盖（或重悬）。
7. 在室温或37℃避光孵育10-45分钟。
8. 用PBS洗涤细胞。
9. 用荧光显微镜检测结果。

显微镜结果分析 ：
荧光显微镜下，使用488nm波长激发，活细胞为黄绿色。
用348 nm波长激发，死细胞为蓝色。


流式细胞仪检测：
1. 收集细胞。
2. 用PBS洗涤细胞两次。
3. 制备1 mL细胞悬浮液，浓度为0.1至5×106细胞/ mL。 细胞可以在无血清培养基或其它缓冲液中重悬。
4. 在细胞中加入适量Calcein-AM溶液和适量NucBlue D母液，混匀。
5. 在室温或37℃避光孵育15-30分钟。
6. 尽快用流式细胞仪检测结果。

图例：

荧光酶标仪检测：
1. 在微孔板中准备细胞样本孔以及对照孔。
2. 用PBS洗涤细胞2-3次。
3. 加入200μl染色工作液。
4. 在室温或37℃避光孵育15-45分钟。
5. 用PBS洗涤细胞。
6. 加入适量PBS。
7. 用荧光酶标仪/荧光光度计检测结果。CalceinAM的激发和发射波长分别为488 nm和515 nm。NucBlue D的激发和发射波长分别为348 nm和469 nm。

酶标仪结果分析 ：
可以根据不同荧光强度来计算样品中活细胞和死细胞相对数量（以百分比表示），或者活细胞/死细胞的绝对数量。
% Live Cells =（F(530)sam – F(530)min）÷ （F(530)max – F(530)min）× 100%

% Dead Cells =（F(470)sam – F(470)min）÷（F(470)max – F(470)min）× 100%

1.所有细胞都染上蓝色？
NucBlue D浓度过高会导致活细胞也被染色，需要优化NucBlue D的使用浓度，稀释至仅对死细胞核染色，而不会对细胞质染色的最佳工作浓度。

2.细胞被同时染上绿色和蓝色？
样本中有大量晚期凋亡细胞时，细胞胞浆会有Calcein着色并呈碎片状，而且NucBlue D也为阳性。

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An injectable chitosan/dextran/β -glycerophosphate hydrogel as cell delivery carrier for therapy of myocardial infarction
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Noninvasive temperature monitoring for dual-modal tumor therapy based on lanthanide-doped up-conversion nanocomposites
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Formation of di-cysteine acrolein adduct decreases cytotoxicity of acrolein by ROS alleviation and apoptosis intervention
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ROS-sensitive biomimetic nanocarriers modulate tumor hypoxia for synergistic photodynamic chemotherapy
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Downregulation of KCTD12 contributes to melanoma stemness by modulating CD271
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Quaternized chitosan-Matrigel-polyacrylamide hydrogels as wound dressing for wound repair and regeneration
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