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产品概述
product description
贝博® BBcellProbe® 活细胞/死细胞染色试剂盒是采用Calcein-AM/EthD-I双染细胞的方法染色活细胞和死细胞。 Calcein-AM是一种可对活细胞进行荧光标记的细胞染色试剂，Calcein-AM由于在Calcein的基础上加强了疏水性，因此能够轻易穿透活细胞膜。当其进入到细胞质后，酯酶会将其水解为Calcein留在细胞内，发出强绿色荧光。与其它同类试剂（如BCECF-AM和Carboxy-fluorescein diacetate）相比，Calcein-AM是最适合作为荧光探针去染活细胞的，因为它的细胞毒性很低。Calcein的激发和发射波长分别为490 nm和515 nm。Calcein -AM仅对活细胞染色。 作为核染色染料的EthD-I （Ethidium Homodimer 1）不能穿过活细胞的细胞膜，它穿过死细胞膜的无序区域而到达细胞核，并嵌入细胞的DNA双螺旋从而产生红色荧光(激发：488nm，528nm，发射：617 nm)，因此EthD-I仅对死细胞染色。 由于Calcein-DNA和EthD-I-DNA都可被490 nm激发，因此可用荧光显微镜同时观察活细胞和死细胞。用545 nm激发，仅可观察到死细胞。根据以上特点，Calcein, AM和EthD-I经常被结合用来作为活细胞和死细胞的双重染色。
保存温度
-20℃避光
注意事项
1.长期不用可以-20℃保存。
2.染色液Calcein AM注意防潮；避免反复冻融。
3.染色液A为DMSO溶液，冬季气温较低时在室温时为凝固状态，极易粘附在管壁、吸头壁。注意需要加热溶解，吸头也需要放在培养箱预热，否者容易再次凝固在吸头内壁产生损耗。融解后离心至管底部再打开螺旋盖。
4.注意需要加热融解，变成液体状态后离心至管底部再开盖。可以用手捂住使其融解或37℃短时间水浴。
5.试剂B溶解后需要用吸头吹打混匀。
6.试剂拆封后请尽快使用完！
2.染色液Calcein AM注意防潮；避免反复冻融。
3.染色液A为DMSO溶液，冬季气温较低时在室温时为凝固状态，极易粘附在管壁、吸头壁。注意需要加热溶解，吸头也需要放在培养箱预热，否者容易再次凝固在吸头内壁产生损耗。融解后离心至管底部再打开螺旋盖。
4.注意需要加热融解，变成液体状态后离心至管底部再开盖。可以用手捂住使其融解或37℃短时间水浴。
5.试剂B溶解后需要用吸头吹打混匀。
6.试剂拆封后请尽快使用完！
有效期
1年
检测方法
1.流式细胞仪 2.激光共聚焦 3.荧光显微镜
适用样本
1.悬浮细胞 2.贴壁细胞
产品应用
1.流式细胞仪 2.激光共聚焦 3.荧光显微镜
试剂准备
1.PBS 缓冲液（pH7.4，实验室常用的10mM磷酸缓冲盐溶液（1X））
2.或者HBSS（Hank's Balanced Salt Solution）
2.或者HBSS（Hank's Balanced Salt Solution）
耗材准备
1.离心管 2.吸头 3.一次性手套
使用注意事项
1.螺旋盖微量试剂管装的试剂在开盖前请短暂离心，将盖内壁上的液体收集至管底，避免开盖时液体洒落。
2.细胞处理需要小心操作,尽量避免人为的损伤细胞。
3.试剂A为DMSO溶液，冬季气温较低时在室温时为凝固状态，极易粘附在管壁、吸头壁。注意需要加热溶解，吸头也需要放在培养箱预热，否者容易再次凝固在吸头内壁产生损耗。融解后离心至管底部再打开螺旋盖。
4.试剂A为了便于观察防止误操作导致损失，在试剂盒中时是采用透明管包装，收到后可以离心移入干燥黑色避光密封管或者用铝箔包裹避光。
5.由于Calcein-AM的稳定性比较差，染色工作液必须现配现用，并且在当天用完。
2.细胞处理需要小心操作,尽量避免人为的损伤细胞。
3.试剂A为DMSO溶液，冬季气温较低时在室温时为凝固状态，极易粘附在管壁、吸头壁。注意需要加热溶解，吸头也需要放在培养箱预热，否者容易再次凝固在吸头内壁产生损耗。融解后离心至管底部再打开螺旋盖。
4.试剂A为了便于观察防止误操作导致损失，在试剂盒中时是采用透明管包装，收到后可以离心移入干燥黑色避光密封管或者用铝箔包裹避光。
5.由于Calcein-AM的稳定性比较差，染色工作液必须现配现用，并且在当天用完。
使用方法
1. 染色工作液的配制：
根据样品数按下列比例配制染色工作液。
用染料稀释液试剂C将染色液A和B分别10倍稀释。
每10ml HBSS缓冲液或无血清培养基中加入100μl稀释过的染色液A，充分混匀，即成染色工作液A。
每10ml HBSS缓冲液或无血清培养基中加入20-200μl稀释过的染色液B，充分混匀，即成染色工作液B。
2. 收集样本细胞。
3. 用PBS洗涤细胞两次。
4. 用200μl染色工作液A将细胞重悬。
5. 在室温或37℃避光孵育15-20分钟。
6. 用PBS洗涤细胞。
7. 用200μl染色工作液B将细胞重悬。
8. 在室温或37℃避光孵育2-5分钟。
9. 用PBS洗涤细胞。
10. 用适量PBS重悬细胞。
11. 用荧光显微镜或流式细胞仪检测结果。最大激发为490nm，最大发射波长为515nm和617nm。
结果分析 ：
荧光显微镜下，使用490±10nm波长激发，活细胞为黄绿色，死细胞为红色。
用528 nm波长激发，能够看到红色的死细胞。
根据样品数按下列比例配制染色工作液。
用染料稀释液试剂C将染色液A和B分别10倍稀释。
每10ml HBSS缓冲液或无血清培养基中加入100μl稀释过的染色液A，充分混匀，即成染色工作液A。
每10ml HBSS缓冲液或无血清培养基中加入20-200μl稀释过的染色液B，充分混匀，即成染色工作液B。
2. 收集样本细胞。
3. 用PBS洗涤细胞两次。
4. 用200μl染色工作液A将细胞重悬。
5. 在室温或37℃避光孵育15-20分钟。
6. 用PBS洗涤细胞。
7. 用200μl染色工作液B将细胞重悬。
8. 在室温或37℃避光孵育2-5分钟。
9. 用PBS洗涤细胞。
10. 用适量PBS重悬细胞。
11. 用荧光显微镜或流式细胞仪检测结果。最大激发为490nm，最大发射波长为515nm和617nm。
结果分析 ：
荧光显微镜下，使用490±10nm波长激发，活细胞为黄绿色，死细胞为红色。
用528 nm波长激发，能够看到红色的死细胞。
常见问题分析
1.所有细胞都染上红色？
EthD-I浓度过高会导致活细胞也被染色，需要优化EthD-I的使用浓度，稀释至仅对死细胞核染色，而不会对细胞质染色的最佳工作浓度。
2.细胞被同时染上绿色和红色？
样本中有大量晚期凋亡细胞时，细胞胞浆会有Calcein着色并呈碎片状，而且EthD-I也为阳性。
EthD-I浓度过高会导致活细胞也被染色，需要优化EthD-I的使用浓度，稀释至仅对死细胞核染色，而不会对细胞质染色的最佳工作浓度。
2.细胞被同时染上绿色和红色？
样本中有大量晚期凋亡细胞时，细胞胞浆会有Calcein着色并呈碎片状，而且EthD-I也为阳性。
参考文献
1.XuekeSun JiaoSun BiaoDong et al.
Noninvasive temperature monitoring for dual-modal tumor therapy based on lanthanide-doped up-conversion nanocomposites
Biomaterials 2019 （IF=8.806）
2.Hang Liu et al.
ROS-sensitive biomimetic nanocarriers modulate tumor hypoxia for synergistic photodynamic chemotherapy
Biomaterials Science 2019 （IF=5.831）
3.Han Wang et al.
Comparison of 3D-printed porous tantalum and titanium scaffolds on osteointegration and osteogenesis
Materials Science and Engineering: C 2019 （IF=4.959）
4.Weiyu Shen et al.
Downregulation of KCTD12 contributes to melanoma stemness by modulating CD271
Cancer Biology & Medicine 2019 （IF=4.467）
5.Dandan Tan, Jinkun Wen, Lixia Li et al.
Inhibition of RhoA-Subfamily GTPases Suppresses Schwann Cell Proliferation Through Regulating AKT Pathway Rather Than ROCK Pathway
Frontiers in Cellular Neuroscience 2018 （IF=4.3）
Noninvasive temperature monitoring for dual-modal tumor therapy based on lanthanide-doped up-conversion nanocomposites
Biomaterials 2019 （IF=8.806）
2.Hang Liu et al.
ROS-sensitive biomimetic nanocarriers modulate tumor hypoxia for synergistic photodynamic chemotherapy
Biomaterials Science 2019 （IF=5.831）
3.Han Wang et al.
Comparison of 3D-printed porous tantalum and titanium scaffolds on osteointegration and osteogenesis
Materials Science and Engineering: C 2019 （IF=4.959）
4.Weiyu Shen et al.
Downregulation of KCTD12 contributes to melanoma stemness by modulating CD271
Cancer Biology & Medicine 2019 （IF=4.467）
5.Dandan Tan, Jinkun Wen, Lixia Li et al.
Inhibition of RhoA-Subfamily GTPases Suppresses Schwann Cell Proliferation Through Regulating AKT Pathway Rather Than ROCK Pathway
Frontiers in Cellular Neuroscience 2018 （IF=4.3）
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