-20℃避光

1.长期不用可以-20℃保存。
2.染色液Calcein AM注意防潮；避免反复冻融。
3.染色液A为DMSO溶液，冬季气温较低时在室温时为凝固状态，极易粘附在管壁、吸头壁。注意需要加热溶解，吸头也需要放在培养箱预热，否者容易再次凝固在吸头内壁产生损耗。融解后离心至管底部再打开螺旋盖。
4.注意需要加热融解，变成液体状态后离心至管底部再开盖。可以用手捂住使其融解或37℃短时间水浴。
5.试剂B溶解后需要用吸头吹打混匀。
6.试剂拆封后请尽快使用完！

1年

1.流式细胞仪
2.激光共聚焦
3.荧光显微镜

1.悬浮细胞
2.贴壁细胞

1.流式细胞仪
2.激光共聚焦
3.荧光显微镜

1.PBS 缓冲液（pH7.4，实验室常用的10mM磷酸缓冲盐溶液（1X））
2.或者HBSS（Hank's Balanced Salt Solution）

1.离心管
2.吸头
3.一次性手套

1.螺旋盖微量试剂管装的试剂在开盖前请短暂离心，将盖内壁上的液体收集至管底，避免开盖时液体洒落。
2.染色液A为DMSO溶液，冬季气温较低时在室温时为凝固状态，极易粘附在管壁、吸头壁。注意需要加热溶解，吸头也需要放在培养箱预热，否者容易再次凝固在吸头内壁产生损耗。融解后离心至管底部再打开螺旋盖。
3.微量试剂A为了便于观察防止误操作导致损失，在试剂盒中时是采用透明管包装，收到后可以离心移入干燥黑色避光密封管或者用铝箔包裹避光。
4.细胞处理需要小心操作,尽量避免人为的损伤细胞。
5.由于Calcein-AM的工作液稳定性比较差，染色工作液必须现配现用，并且在当天用完。
6.Calcein-AM对湿度非常敏感，若是Calcein-AM溶液每次取完需要量后，必须紧紧密封盖子。建议根据单次用量，分装密封保存。不可使用含水的吸头。
7.试剂A母液请拧紧螺旋盖，避免受潮失效。
8.以下以培养细胞收集后染色为例。原位染色以染色液充分覆盖细胞样本即可。
9.有效染色的前提是相应的细胞模型的活力变化是酯酶活性变化和质膜完整性变化这些物理和生化特性，不影响这些细胞特性的细胞毒性事件可能不能使用此方法进行准确评估。

染色工作液的配制：
根据样品数按下列比例配制染色工作液。
用染料稀释液试剂C将染色液A和B分别10倍稀释。
每10ml HBSS缓冲液或无血清培养基中加入100μl稀释过的染色液A，充分混匀，即成染色工作液A。
每10ml HBSS缓冲液或无血清培养基中加入20-200μl稀释过的染色液B，充分混匀，即成染色工作液B。


荧光显微镜观察：
1. 准备样本细胞。
2. 用PBS洗涤细胞2-3次。
3. 用100-150μl染色工作液A至盖玻片将细胞样品覆盖（或重悬）。
4. 在室温或37℃避光孵育20-45分钟。
5. 用PBS洗涤细胞。
6. 用100-150μl染色工作液B至盖玻片将细胞覆盖（或重悬）。
7. 在室温或37℃避光孵育10-45分钟。
8. 用PBS洗涤细胞。
9. 用荧光显微镜检测结果。最大激发为490nm，最大发射波长为515nm和617nm。

显微镜结果分析 ：
荧光显微镜下，使用488nm波长激发，活细胞为黄绿色，死细胞为红色。
用545 nm波长激发，仅能够看到红色的死细胞。


流式细胞仪检测：
1. 收集细胞。
2. 用PBS洗涤细胞两次。
3. 制备1 mL细胞悬浮液，浓度为0.1至5×106细胞/ mL。 细胞可以在无血清培养基或其它缓冲液中重悬。
4. 在细胞中加入适量Calcein-AM溶液和适量PI母液，混匀。
5. 在室温或37℃避光孵育15-30分钟。
6. 尽快用流式细胞仪检测结果。



荧光酶标仪检测：
1. 在微孔板中准备细胞样本孔以及对照孔。
2. 用PBS洗涤细胞2-3次。
3. 加入200μl染色工作液。
4. 在室温或37℃避光孵育15-45分钟。
5. 用PBS洗涤细胞。
6. 加入适量PBS。
7. 用荧光酶标仪/荧光光度计检测结果。最大激发为490nm，最大发射波长为525nm和617nm。

酶标仪结果分析 ：
可以根据不同荧光强度来计算样品中活细胞和死细胞相对数量（以百分比表示），或者活细胞/死细胞的绝对数量。
% Live Cells =（F(530)sam – F(530)min）÷ （F(530)max – F(530)min）× 100%

% Dead Cells =（F(620)sam – F(620)min）÷（F(620)max – F(620)min）× 100%

1.所有细胞都染上红色？
PI浓度过高会导致活细胞也被染色，需要优化PI的使用浓度，稀释至仅对死细胞核染色，而不会对细胞质染色的最佳工作浓度。

2.细胞被同时染上绿色和红色？
样本中有大量晚期凋亡细胞时，细胞胞浆会有Calcein着色并呈碎片状，而且PI也为阳性。

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An injectable chitosan/dextran/β -glycerophosphate hydrogel as cell delivery carrier for therapy of myocardial infarction
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Noninvasive temperature monitoring for dual-modal tumor therapy based on lanthanide-doped up-conversion nanocomposites
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Formation of di-cysteine acrolein adduct decreases cytotoxicity of acrolein by ROS alleviation and apoptosis intervention
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ROS-sensitive biomimetic nanocarriers modulate tumor hypoxia for synergistic photodynamic chemotherapy
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Comparison of 3D-printed porous tantalum and titanium scaffolds on osteointegration and osteogenesis
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Downregulation of KCTD12 contributes to melanoma stemness by modulating CD271
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Quaternized chitosan-Matrigel-polyacrylamide hydrogels as wound dressing for wound repair and regeneration
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