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贝博® BBcellProbe® Caspase-8 活性检测试剂盒(Caspase 8 Activity Assay Kit)是采用荧光法检测细胞或组织裂解液中Caspase 8酶活性或纯化的Caspase 8酶活性的试剂盒。 本Caspase 8 活性检测试剂盒是基于casepase 8可以催化Caspase-8荧光底物产生绿色荧光产物AFC，AFC在400nm激发，发射波长505nm。生成的AFC量与caspase 8的活性成正比，从而可以通过测定荧光强度来检测caspase 8的活性。 Caspase(Cysteine-requiring Aspartate Protease)是一个在细胞凋亡过程中起重要作用的蛋白酶家族。Caspase(Cysteine-requiring Aspartate Protease)是一个在细胞凋亡过程中起重要作用的蛋白酶家族。Caspase 8被认为是细胞凋亡信号转导过程中比较上游的一个caspase。在Fas-receptor和TNFR-1介导的细胞凋亡过程中caspase 8被激活，形成一个由p18和p10组成的二聚体，进一步激活下游的caspase 4，caspase 6，caspase 9和caspase 10。 本试剂盒可用于培养细胞或新鲜组织样本的caspase-8检测。 贝博还可以提供R110，AMC等荧光标记的Caspase-8活性检测试剂盒。没有荧光检测条件，可以选择贝博的比色法Caspase-7活性检测试剂盒（相关产品BB-4107）。
2.荧光底物为DMSO溶液，冬季气温较低时为凝固状态，极易粘附在管壁、吸头壁。注意需要加热融解，变成液体状态后离心至管底部再开盖。
3.可以用手捂住使其融解或37℃短时间水浴。吸头也需要放在培养箱预热，否者容易再次凝固在吸头内壁产生损耗。
2.组织
2.离心机
3.移液器
4.冰箱
5.冰盒
2.或者HBSS（Hank's Balanced Salt Solution）
2.吸头
3.一次性手套
2.样品适合采用Bradford法进行蛋白浓度测定。
3.如果样品中蛋白含量低，裂解样品时需设法使样品中的蛋白浓度在10mg/ml以上。
4. 如果样品中激活的caspase水平很低，适当调节诱导细胞凋亡的时间，找一个caspase激活比较强的时间点进行检测。
5.Caspase-8底物避光保存，使用过程中尽量避光。
6.底物为DMSO溶液，冬季气温较低时在室温时为凝固状态，极易粘附在管壁、吸头壁。注意需要加热溶解，吸头也需要放在培养箱预热，否者容易再次凝固在吸头内壁产生损耗。
7. 使用前，先将本品取出回温至室温，并对其进行简短离心使DMSO溶液集中于管底。
根据待测样品数准备裂解缓冲液和检测缓冲液，每1ml缓冲液中加入10ul DTT。充分混匀置冰上备用。
二、 样品处理
A． 细胞样品
1. 收集5×106个细胞，在4℃，500×g条件下离心5分钟，小心吸取培养基，尽可能吸干，收集细胞。
2. 用冷PBS洗涤细胞两次，每次洗涤后尽可能吸干上清。
3. 在细胞中加入50μl冷的裂解缓冲液，高速涡旋振荡15秒。
4. 置冰上持续振荡15-30分钟。
5. 在4℃，12000×g条件下离心15分钟。
6. 快速将上清吸入另一预冷的干净离心管，置于冰上保存备用。
B． 组织样品
1. 取适量组织样本剪碎，按照每50mg/100μl冷的裂解缓冲液，用组织匀浆器匀浆至无明显肉眼可见固体（或用液氮研磨），冰上振荡15-30分钟，小心将上清吸入另一预冷的干净离心管。
2. 在4℃，12000×g条件下离心5分钟。
3. 快速将上清吸入另一预冷的干净离心管，置于冰上或-80℃冰箱保存备用。
三、 对上述处理过的上清进行蛋白定量。
四、 Caspase 8活性检测
1. 取50ul裂解上清（含100-200ug蛋白），加入50ul检测缓冲液。
2. 再加入5ul caspase-8荧光底物，充分混匀，在37℃下避光反应1-2小时。
3. 荧光酶标仪检测。Ex=400nm，Em=505nm。
1. 样品上样量不够：本方法检测需要的细胞数量须在3×106以上，或者新鲜组织50mg以上，每次反应的蛋白量需要在100ug以上。如果量不够，请增加细胞或组织的量。
2. 样本不新鲜：使用新鲜的细胞或组织样本。
3. 样品裂解不够充分：细胞或组织需要进行充分裂解，最好可以加入适当的蛋白酶抑制剂混合物裂解，裂解后应无明显大量的沉淀，以保证有效获得蛋白。
4. 样品中激活的caspase-8水平偏低：首先确认模型的凋亡现象是否明显，以及根据文献和其他验证方法确认该凋亡是否激活caspase-8。
5. 检测时间点的选择是否合适：不论哪种通路的凋亡，需要在caspase-8被有效激活并达到相应活化程度后的一定时间范围内检测，过早或过晚均不合适。
6. 不适合本方法检测：某些凋亡诱导剂诱导的凋亡可能是非依赖于caspase-8活化的机制，此种情况时利用本试剂盒检测caspase-8无明显变化，需要考虑凋亡机制的其他通路。
N-Isopropylacrylamide-modified polyethylenimine-mediated p53 gene delivery to prevent the proliferation of cancer cells
Colloids and Surfaces B: Biointerfaces 2015 （IF=3.902）
2. Gang Wang, Jun Jie Wang et al.
Role of SIRT1-mediated mitochondrial and Akt pathways in glioblastoma cell death induced by Cotinus coggygria flavonoid nanoliposomes
Int J Nanomedicine 2015 （IF=4.32）
3. G Wang et al.
The JAK2/STAT3 and mitochondrial pathways are essential for quercetin nanoliposome-induced C6 glioma cell death
Cell Death and Disease 2013 （IF=6.044）
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