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贝博® BBcellProbe® Caspase 9 活性检测试剂盒(Caspase 9 Activity Assay Kit)是采用分光光度法检测细胞或组织裂解液中Caspase 9酶活性或纯化的Caspase 9酶活性的试剂盒。 贝博® BBcellProbe® Caspase 9 活性检测试剂盒是基于casepase 9可以催化Caspase-9底物产生黄色的pNA，pNA在405nm附近有强吸收，从而可以通过测定吸光度来检测caspase 9的活性。 Caspase(Cysteine-requiring Aspartate Protease)是一个在细胞凋亡过程中起重要作用的蛋白酶家族。线粒体释放细胞色素c以后，caspase 9可以和细胞色素c以及Apaf1形成复合物，同时被激活。激活的caspase 9可以激活细胞凋亡的最关键酶caspase 3，从而促进后续的细胞凋亡信号。Caspase 9的激活可以通过磷酸化进行调控。 本试剂盒用酶标仪检测或容量不超过100μl的分光光度检测杯检测，可用于培养细胞或新鲜组织样本的caspase-9检测。 贝博® BBcellProbe® 还可以提供荧光标记的Caspase-9 活性检测试剂盒（相关产品BB-41082）。荧光法检测的灵敏度远高于分光光度法，有荧光检测条件者尽可能选择荧光法的检测试剂盒。没有荧光检测条件，可以选择贝博的比色法Caspase-9活性检测试剂盒，需要确保样品中Caspase-9活化程度足够高。
2.Caspase底物在冬季气温较低时在室温时为凝固状态，极易粘附在管壁、吸头壁。注意需要加热融解，吸头也需要放在培养箱预热，否者容易再次凝固在吸头内壁产生损耗。融解后离心至管底部再打开螺旋盖。
3.可以用手捂住使其融解或37℃短时间水浴。
2.分光光度计
2.组织
2.分光光度计
2.离心机
3.移液器
4.冰箱
5.冰盒
2.或者HBSS（Hank's Balanced Salt Solution）
2.吸头
3.一次性手套
2.37℃下反应如果颜色变化不明显，可以适当延长反应时间。
3.如果样品中蛋白含量低，加大样品量，裂解样品时需设法使样品中的蛋白量达到200-500ug每样。
4.如果样品中激活的caspase水平很低，适当调节诱导细胞凋亡的时间，找一个caspase激活比较强的时间点进行检测。
5. Caspase-9底物避光保存，使用过程中尽量避光。
6. 底物为DMSO溶液，冬季气温较低时在室温时为凝固状态，极易粘附在管壁、吸头壁。注意需要加热溶解，吸头也需要放在培养箱预热，否者容易再次凝固在吸头内壁产生损耗。
7. 使用前，先将本品取出回温至室温，并对其进行简短离心使DMSO溶液集中于管底。
根据待测样品数准备裂解缓冲液和检测缓冲液，每1ml缓冲液中加入10ul DTT。
充分混匀置冰上备用。
二、 样品处理
A． 细胞样品
1. 收集2-5×106个细胞，在4℃，500×g条件下离心5分钟，小心吸取培养基，尽可能吸干，收集细胞。
2. 用冷PBS洗涤细胞两次，每次洗涤后尽可能吸干上清。
3. 在细胞中加入50μl冷的裂解缓冲液，高速涡旋振荡15秒。
4. 置2-8℃持续振荡15-30分钟。
5. 在4℃，12000×g条件下离心15分钟。
6. 将上清吸入另一预冷的干净离心管，置于冰上或-80℃冰箱保存备用。
B． 组织样品
1. 取适量组织样本，用手术剪刀尽可能剪碎。
2. 按照50mg/100μl加入冷的裂解缓冲液，用组织匀浆器匀浆至无明显肉眼可见固体。
3. 在2-8℃振荡15-30分钟，小心将上清吸入另一预冷的干净离心管。
4. 在4℃，12000×g条件下离心5分钟。
5. 快速将上清吸入另一预冷的干净离心管，置于冰上保存备用。
三、 对上述处理过的上清进行蛋白定量。
四、 Caspase 9活性检测
1. 取50ul大约含100-200ug蛋白的裂解上清，加入40ul检测缓冲液。
2. 再加入10ul caspase-9底物，充分混匀。在37℃下避光反应1-4小时，有黄色颜色产生即可进行检测，如果颜色变化不明显，时间可以延长，甚至孵育过夜。部分样品中激活的caspase-9水平较低，颜色变化不明显，直接上机检测，与对照组样品产品变化即可。
3. 测定A405nm或A400nm。
4. 根据凋亡诱导的细胞的吸光值与空白对照细胞的吸光值的比值计算相对的Caspase 9活性程度。
比色法caspase-9活性检测方法常见的问题主要为测得的OD值偏低，颜色变化不明显，无法显示与对照组细胞的差异，其可能的原因主要集中在以下几个方面：
1. 样品上样量不够：本方法检测需要的细胞数量须在3×106以上，或者新鲜组织50mg以上，每次反应的蛋白量需要在100ug以上。如果量不够，请增加细胞或组织的量。
2. 样本不新鲜：使用新鲜的细胞或组织样本。
3. 样品裂解不够充分：细胞或组织需要进行充分裂解，最好可以加入适当的蛋白酶抑制剂混合物裂解，裂解后应无明显大量的沉淀，以保证有效获得蛋白。
4. 样品中激活的caspase-9水平偏低：首先确认模型的凋亡现象是否明显，以及根据文献和其他验证方法确认该凋亡是否激活caspase-9。
5. 检测时间点的选择是否合适：不论哪种通路的凋亡，需要在caspase-9被有效激活并达到相应活化程度后的一定时间范围内检测，过早或过晚均不合适。
6. 不适合本方法检测：某些凋亡诱导剂诱导的凋亡可能是非依赖于caspase-9活化的机制，此种情况时利用本试剂盒检测caspase-9无明显变化，需要考虑凋亡机制的其他通路。
Peptide-functionalized upconversion nanoparticles-based FRET sensing platform for Caspase-9 activity detection in vitro and in vivo
Biosensors and Bioelectronics 2019 （IF=9.518）
2.Yuanxin Zhang, et al.
DNA-Hybrid-Gated Photothermal Mesoporous Silica Nanoparticles for NIR-Responsive and Aptamer-Targeted Drug Delivery
ACS Appl. Mater. Interfaces 2015 （IF=8.456）
3.G Wang, et al.
The JAK2/STAT3 and mitochondrial pathways are essential for quercetin nanoliposome-induced C6 glioma cell death
Cell Death and Disease 2013 （IF=6.044）
4. Ting Li, et al.
Differential effects of polyphenols-enriched extracts from hawthorn fruit peels and fleshes on cell cycle and apoptosis in human MCF-7 breast carcinoma cells
Food Chemistry 2013 （IF=5.399）
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