2-8℃ 避光保存

1. Caspase-1底物短期4℃避光保存，长期-20℃避光保存；。
2. Caspase底物在冬季气温较低时在室温时为凝固状态，极易粘附在管壁、吸头壁。注意需要加热融解，吸头也需要放在培养箱预热，否者容易再次凝固在吸头内壁产生损耗。融解后离心至管底部再打开螺旋盖。
3.可以用手捂住使其融解或37℃短时间水浴。

一年

荧光酶标仪/荧光光度计

1.细胞 2.组织

荧光酶标仪

1.荧光酶标仪/荧光光度计
2.离心机
3.移液器
4.冰箱
5.冰盒

1.PBS缓冲液
2.蛋白定量试剂盒

1.离心管
2.吸头
3.一次性手套
4.荧光检测专用的黑色96孔板

1. 37℃下反应如果颜色变化不明显，可以适当延长反应时间。
2.如果样品中蛋白含量低，加大样品量，裂解样品时需设法使样品中的蛋白量达到200-500 ug每样。
3.如果样品中激活的caspase水平很低，适当调节诱导细胞凋亡的时间，找一个caspase激活比较强的时间点进行检测。
4. Caspase-1底物避光保存，使用过程中尽量避光。
5. 底物为DMSO溶液，冬季气温较低时在室温时为凝固状态，极易粘附在管壁、吸头壁。注意需要加热溶解，吸头也需要放在培养箱预热，否者容易再次凝固在吸头内壁产生损耗。6. 使用前，先将本品取出回温至室温，并对其进行简短离心使DMSO溶液集中于管底。7. 酶标仪检测必须使用荧光检测专用的黑色96孔板。

一、 裂解缓冲液和检测缓冲液配制
根据待测样品数准备裂解缓冲液和检测缓冲液，每1 ml缓冲液中加入10 μl DTT。
充分混匀置冰上备用。
二、 样品处理A．
细胞样品
1. 收集5×106个细胞，在4℃，500×g条件下离心5分钟，小心吸取培养基，尽可能吸干，收集细胞。
2. 用冷PBS洗涤细胞两次，每次洗涤后尽可能吸干上清。
3. 在细胞中加入50 μl冷的裂解缓冲液，高速涡旋振荡15秒。
4. 置冰上持续振荡20-45分钟
5. 在4℃，12000×g条件下离心15分钟。6. 快速将上清吸入另一预冷的干净离心管，置于冰上保存备用。

B． 组织样品
1. 取适量组织样本剪碎，按照每50 mg/100 μl冷的裂解缓冲液，用组织匀浆器匀浆至无明显肉眼可见固体，冰上振荡20-45分钟，小心将上清吸入另一预冷的干净离心管。
2. 在4℃，12000×g条件下离心5分钟。
3. 快速将上清吸入另一预冷的干净离心管，置于冰上或-80℃冰箱保存备用。

三、 对上述处理过的上清进行蛋白定量。
【注】：
1.必须进行蛋白定量，以保证后续步骤的蛋白上样量足够，否则容易出现检测不到结果的情况。
2.用BCA蛋白定量试剂盒进行定量的话，裂解液中不要加入DTT。

四、 Caspase 1活性检测
1、 取50 μl裂解上清（含100-200 ug蛋白），加入45 μl检测缓冲液。
2、 再加入5 μl caspase-1荧光底物，充分混匀，在37℃下避光反应1-2小时。【注】： Caspase-1水平较低时需要延长反应时间。
3、 荧光酶标仪检测荧光强度。Ex=360 nm，Em=430 nm。
4、 根据凋亡的细胞的荧光值与对照细胞样本的荧光值的比值计算相对的Caspase 1活性程度变化。

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Redox DAPK1 destabilizes Pellino1 to govern inflammation-coupling tubular damage during septic AKI
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A potential adjuvant chemotherapeutics, 18β-glycyrrhetinic acid, inhibits renal tubular epithelial cells apoptosis via enhancing BMP-7 epigenetically through targeting HDAC2
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