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贝博® BBcellProbe® 活细胞/死细胞染色试剂盒是采用Calcein-AM/7-AAD双染细胞的方法染色活细胞和死细胞。 Calcein-AM是一种可对活细胞进行荧光标记的细胞染色试剂，Calcein-AM由于在Calcein的基础上加强了疏水性，因此能够轻易穿透活细胞膜。当其进入到细胞质后，酯酶会将其水解为Calcein留在细胞内，发出强绿色荧光。与其它同类试剂（如BCECF-AM和Carboxy-fluorescein diacetate）相比，Calcein-AM是最适合作为荧光探针去染活细胞的，因为它的细胞毒性很低，而且不会抑制任何的细胞功能，如增殖和淋巴球的趋化性。Calcein的激发和发射波长分别为490 nm和515 nm。Calcein -AM仅对活细胞染色。 作为核染色染料的7-AAD不能穿过活细胞的细胞膜，它穿过死细胞膜的无序区域而到达细胞核，并嵌入细胞的DNA双螺旋从而产生红色荧光(激发：488，546nm，发射：647 nm)，因此7-AAD仅对死细胞染色。 根据以上特点，Calcein, AM和7-AAD经常被结合用来作为活细胞和死细胞的双重染色。 一般试剂盒采用PI与Calcein联用，但是由于PI的发射波长是<625nm,通常在FL2中检测,对FITC的干扰大。而且由于波谱较宽，同时在FL3中也能测，所以用了PI最多再加一个FITC，FL3就没法用了。PI还有一个重要的缺点是不容易清洗干净,使用后清洗流式细胞仪更加费时费物。 贝博® BBcellProbe® 7-AAD/Calcein AM试剂盒有效的解决了这些弊端，7-AAD的发射波长是650nm,只占用FL3通道进行检测，FITC、PE两个通道受影响都小，可以做三色分析。
2.染色液Calcein AM注意防潮；避免反复冻融。
3.染色液为DMSO溶液，冬季气温较低时在室温时为凝固状态，极易粘附在管壁、吸头壁。注意需要加热溶解，吸头也需要放在培养箱预热，否者容易再次凝固在吸头内壁产生损耗。融解后离心至管底部再打开螺旋盖。
4.注意需要加热融解，变成液体状态后离心至管底部再开盖。可以用手捂住使其融解或37℃短时间水浴。
5.试剂拆封后请尽快使用完！
2.或者HBSS（Hank's Balanced Salt Solution）
2.染色液A为DMSO溶液，冬季气温较低时在室温时为凝固状态，极易粘附在管壁、吸头壁。注意需要加热溶解，吸头也需要放在培养箱预热，否者容易再次凝固在吸头内壁产生损耗。融解后离心至管底部再打开螺旋盖。
3.试剂A为了便于观察防止误操作导致损失，在试剂盒中时是采用透明管包装，收到后可以离心移入干燥黑色避光密封管或者用铝箔包裹避光。
4.细胞处理需要小心操作,尽量避免人为的损伤细胞。
5.由于Calcein-AM的工作液稳定性比较差，染色工作液必须现配现用，并且在当天用完。
6.Calcein-AM对湿度非常敏感，若是Calcein-AM溶液每次取完需要量后，必须紧紧密封盖子。建议根据单次用量，分装密封保存。不可使用含水的吸头。
7.试剂A母液请拧紧螺旋盖，避免受潮失效。
根据样品数按下列比例配制染色工作液。
用染料稀释液试剂C将染色液A和B分别10倍稀释。
用HBSS缓冲液或无血清培养基100倍稀释以上稀释过的染色液A，充分混匀，即成染色工作液A。
用HBSS缓冲液或无血清培养基20倍稀释以上稀释过的染色液B，充分混匀，即成染色工作液B。
2. 收集样本细胞。
3. 用PBS洗涤细胞两次。
4. 用200ul Calcein-AM染色工作液将细胞重悬。
5. 在37℃避光孵育15-30分钟。
6. 用PBS洗涤细胞。
7. 用200ul 7-AAD染色工作液将细胞重悬。
8. 在室温或37℃避光孵育5-10分钟。
9. 用PBS洗涤细胞。
10. 用适量PBS重悬细胞。
11. 用荧光显微镜或流式细胞仪检测结果。最大激发为490nm，最大发射波长为515nm和647nm。
结果分析 ：
荧光显微镜下，使用488nm波长激发，活细胞为黄绿色，死细胞为红色。
用546 nm波长激发，仅能够看到红色的死细胞。
7-AAD浓度过高会导致活细胞也被染色，需要优化7-AAD的使用浓度，稀释至仅对死细胞核染色，而不会对细胞质染色的最佳工作浓度。
2.细胞被同时染上绿色和红色？
样本中有大量晚期凋亡细胞时，细胞胞浆会有Calcein着色并呈碎片状，而且7-AAD也为阳性。
Noninvasive temperature monitoring for dual-modal tumor therapy based on lanthanide-doped up-conversion nanocomposites
Biomaterials 2019 （IF=8.806）
2.MengWangXin LiuPingping et al.
Transformation of lignosulfonate into graphene-like 2D nanosheets: Self-assembly mechanism and their potential in biomedical and electrical applications
International Journal of Biological Macromolecules 2019 （IF=3.909）
3.Dandan Tan, Jinkun Wen, Lixia Li et al.
Inhibition of RhoA-Subfamily GTPases Suppresses Schwann Cell Proliferation Through Regulating AKT Pathway Rather Than ROCK Pathway
Frontiers in Cellular Neuroscience 2018 （IF=4.3）
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