2-8℃避光

1.染料短期2周内可以2-8℃保存。染料长期不用可以-20℃保存。避免反复冻融。
2.探针液A为DMSO溶液，冬季气温较低时为凝固状态，极易粘附在管壁、吸头壁。注意需要加热融解，变成液体状态后离心至管底部再开盖。
3.可以用手捂住使其融解或37℃短时间水浴。吸头也需要放在培养箱预热，否者容易再次凝固在吸头内壁产生损耗。
4.试剂拆封后请尽快使用完！

六个月

1.流式细胞仪
2.激光共聚焦
3.荧光显微镜

1.悬浮细胞
2.贴壁细胞

1.流式细胞仪
2.激光共聚焦
3.荧光显微镜

1.PBS 缓冲液（pH7.4，实验室常用的10mM磷酸缓冲盐溶液（1X））
2.或者HBSS（Hank's Balanced Salt Solution）

1.离心管
2.吸头
3.一次性手套

1.螺旋盖微量试剂管装的试剂在开盖前请短暂离心，将盖内壁上的液体收集至管底，避免开盖时液体洒落。
2.M09探针在冬天温度较低时会凝固，可以20～25℃水浴温育片刻全部融解后离心使用。
3.细胞处理需要小心操作,尽量避免人为的损伤细胞。
4.始终保持平衡染液中pH值的一致性，因为pH值的变化将影响膜电位。
5.与染料达到平衡的细胞悬液中如果含有蛋白，他们将与部分染料结合，降低染料的浓度，引起假去极化。
6.根椐细胞种类、实验条件不同流式细胞仪设置不同。
7.M09染色并洗涤后尽量在30分钟内完成后续检测。
8.M09染色探针不可以一次性全部配好，应根据每次细胞数量现配现用，长期不用的可以分装后用铝箔纸包好-20℃冻存。避免反复冻融。

以下以细胞为例，实验步骤仅做参考，具体最佳细胞数量，最佳染色时间，因细胞不同而不同，根据实际情况调整。

细胞准备：
贴壁细胞：96孔板，细胞数量约40000-80000/孔，100 μl培养基。
悬浮细胞：96孔板，细胞数量约125000-250000/孔，100 μl培养基。
组织样本：组织样本可以用玻璃匀浆器匀浆成单细胞悬液后按照细胞样本的方法检测。也可以用其他细胞悬液制备的试剂盒处理组织后检测。

染色工作液准备：
1. 在HBSS缓冲液中加入终浓度为20mM的Hepes缓冲液。置37℃培养箱预热。
2. 根据样本数量，用37℃培养箱预热的染料稀释液试剂B将BBcellProbe® M09荧光染料10倍稀释。再用以上HBSS或相应的无血清培养基或其他缓冲液将探针M09进行100-500倍稀释，配制成1X染色工作液。

染色：
1. 如果是在培养板原位检测，移除培养基，用PBS洗细胞一次，加入100 μl染色工作液。
2. 如果流式检测，收集样本细胞，细胞数量在2-5X105个。用PBS洗涤细胞两次。离心收集细胞。然后用500 μl-1000 μl M09染色工作液将细胞重悬。
3. 加入染色工作液的细胞在培养箱中或者室温避光孵育30分钟-1小时。
4. 用荧光酶标仪/激光共聚焦显微镜或流式细胞仪/荧光分光光度计检测分析结果。
用荧光酶标仪或激光共聚焦显微镜检测。检测相关刺激后荧光强度的变化。
或者用流式细胞仪、荧光分光光度计检测：激发波长为488nm，发射波长为515nm左右。如果激发波长不能设置为488nm 时，可以在488-493nm 范围内设置激发波长。

结果分析 ：
检测时可以把激发光设置为488nm，发射光设置为515-520nm；
荧光强度增加，表示细胞去极化，探针流入细胞。显示细胞跨膜电位较原来的参照状态或参照细胞更正，膜电位的绝对值变低。
荧光强度降低，表示细胞超极化，探针流出细胞。显示细胞跨膜电位较原来的参照状态或参照细胞更负，膜电位的绝对值变高。