2-8℃

1.蛋白酶抑制剂未开盖使用前也可以2-8℃储存。开盖使用后-20℃储存。 2.蛋白酶抑制剂在2-8℃低温时是固体状态，从冰箱取出后恢复至室温或37℃短时间水浴，变成液体状态后离心至管底部再开盖。 3.试剂拆封后请尽快使用完！

一年

WB,IP等

液体

WB,IP等

1.离心机2.振荡器3.匀浆机/匀浆器4.涡旋混匀器5.移液器6.冰箱7.冰盒

1.PBS缓冲液 （pH7.4，实验室常用的10mM磷酸缓冲盐溶液（1X）） （phosphate buffer saline/Dulbecco’s PBS：约含8mM Na2HPO4、2mM KH2PO4、137mM NaCl和3mM KCl）2.蛋白定量试剂盒

1.离心管2.吸头3.一次性手套

1.在操作过程中，一个离心套管可用于收集滤出液，而另一个用于回收提取后的样本。 2.用过的蛋白提取管要保持过滤膜湿润，不能干掉。

清洗蛋白提取管：1. 用缓冲液或纯水进行预清洗。也可先用0.1 M NaOH清洗，再用缓冲液或纯水进行二次清洗。 2. 离心管中的过滤膜一旦润湿后应避免变干。如果在预清洗后不是立即使用，则让液体保留在滤膜上，直到使用。样品处理:1. 在500 μl待提取液体样品中加入5 μl蛋白吸附抑制剂。充分混匀。【注】： 吸附抑制剂按照1/100加到待提取液体样品。2. 每500 μl液体样本中加入100 μl蛋白提取液，充分混匀后，在4℃条件下振荡5-10分钟。【注】： 使用振荡器/摇床的较低转速，提取液能轻微晃动即可。 没有振荡条件也可以不振荡，置2-8℃静置，稍微延长提取液的处理时间，中间每隔几分钟用移液器吹打混匀即可。3. 在4℃，15000×g条件下离心15分钟。4. 将上清吸入另一预冷的干净离心管，待后续蛋白提取管离心过滤。蛋白提取管使用方法：使用注意事项： 不同的液体样本的离心速度不同，有的需要长时间离心，有的则很快就好。和液体中蛋白样品纯度，所用buffer类型，蛋白的浓度有关系。离心时要先短些时间，观察一下速度； 如果需要多次重复使用，离心速度不要太高； 样品体积大就分批离心，尽可能不要离心时间太长。 样品里的杂质如果可能尽量在离心前去除一些。 吸附损失取决于溶质浓度、疏水性、与过滤提取管表面接触的温度和时间、样本成分及pH。为了最大限度降低损失，离心后请立即回收提取后的样本。 如果样本的起始浓度很高，离心过程中会出现沉淀，这也可能带来样本损失。 样本有可能穿过滤膜，务必将每次的滤过液一直保留到提取样品分析测试完成。 样品中蛋白最低起始浓度为25ug/ml。 加蛋白液或Buffer到蛋白提取管时，可以用蓝枪头；但从蛋白管底吸取提取好的目的蛋白时，必须用黄枪头；用枪头伸入蛋白管中时，必须防止碰到滤膜，以免戳破滤膜。操作步骤：1. 将内管插入所提供的一个微量离心管中。2. 向内管中加入不超过500 μl的以上步骤中处理过的液体样本，并盖上盖子。3. 将盖好盖子的蛋白提取管放入离心转子中，让盖子的连接带朝着转子的中央；用一个类似的离心管平衡。4. 以2000-10000 x g离心约10-30分钟。【注】： 务必将滤过液一直保留到提取的样品分析测试完成。 影响流速的因素包括样本浓度、起始体积、溶质的化学性质、相对离心力、离心转子的角度以及温度。500ul样本的典型离心时间大约是10至30分钟。尽管大部分样本在离心开始后的前5至10分钟发生过滤，但在离心10至30分钟后才能达到最低的剩余体积（15-20ul）。 根据不同的起始蛋白量决定离心后的剩余体积。起始蛋白浓度极低的液体样品（如培养上清等）可以离心至剩余20ul，起始蛋白浓度高的液体样品（如腹水脑脊液等）可以离心至剩余100-200ul。5. 离心结束后将整个蛋白提取管从离心机中取出，取出内管。6. 为了回收过滤后的液体，将内管倒过来插在另一个干净的微量离心管中。放在离心机中，让打开的盖子朝着转子的中央；用一个类似的离心管进行平衡。以1,000 x g离心2分钟，使剩余后的样本从蛋白提取内管转移到收集管中。滤液可以保存在收集管中。【注】： 要达到理想的回收效果，请尽早进行倒置离心。 也可不倒置离心，直接用移液器直接吸出内管中的样品。7. 将蛋白提取管清洗后用于提取其它液体蛋白样品。【注】： 一般每个蛋白提取管重复使用10次。清洗和保存：1. 使用后用水冲洗干净；2. 内管加入超纯水500 µl，5000g离心5分钟；3. 净内管中的水，加入500 µl 0.1M NaOH，5000g离心20分钟；4. 用0.1 M NaOH 浸泡24小时；5. 用水冲洗干净；6. 用无菌水浸泡2-8℃保存。7. 外管用自来水洗净后，用超纯水冲洗干净，晾干。【注】： 1个月不用的话，直接用100 mM的NaOH保存！更长时间的话加0.02%的叠氮钠。 再次使用前，用纯水充分冲洗干净，然后在用样品缓冲液平衡。

1.膜会因为离心时间过长而变干么？不会，因为蛋白管有死体积，总会有溶液残留在滤管中。死体积大约10-20ul。 可以重复使用蛋白管么？可以重复使用。如果使用、清洗、保存得当，可以反复使用多次。但是多次重复使用后过滤膜有破损风险，注意使用过程中尽量避免尖锐物品戳到膜。离心力不要过大。 蛋白在提取时出现了沉淀，如何改进？蛋白如果离心过快或者过度浓缩都有可能引起蛋白沉淀。建议蛋白提取后的最终浓度不超过20 mg/ml。对于对离心速度敏感而容易沉淀的蛋白，建议的改进方法是：1）离心力降低30%-50%2）在离心过程中取出蛋白管，用枪头反复吹吸几次 提取后发现提取液中没有目的蛋白，可能的原因有哪些？蛋白管的蛋白最低起始浓度为25ug/ml。请确保的样本的起始浓度大于这个浓度。如果问题仍然出现，请不要丢弃样本滤过液以便用于分析可能的原因：1）如果目的样本在滤过液中，那么请排查：a）使用的离心力是否是在限定范围内？如果使用的是rpm，请换算成相应的g离心力，具体换算方法请垂询。b）离心机最近是否有校准过？2）如果目的样本也不在滤过液中，那么：a）蛋白样本起始浓度是否大于25ug/mL？b）用来确定样本浓度的方法是什么？是否可信？c）目的蛋白是不是沉淀了？ 有时候用蛋白提取离心管连水都离不下来，可能是什么原因？如果出现这种情况，可能时过滤膜的孔被堵住。请先用0.1M NaOH清洗再离心。最后用缓冲液或纯水再次清洗后甩干。清洗后的滤膜应立即使用，如暂时不用，请保持润湿状态，避免重新干燥。 2.说明书中推荐在室温下进行离心，考虑到蛋白的稳定性，是否可以在4℃进行离心？ 可以，但是低温会增加蛋白样品的粘性，导致流速减慢，建议可将离心时间延长。 3.是否可以用于高压灭菌？不可以，蛋白管都是采用热封设计，不可以用高压高温灭菌。 4.没有液流流出，为什么？ 可能是溶液比较粘稠或浓度太高； 5.蛋白管可以去除去垢剂吗？去垢剂因其独特的性质，当浓度大于临界微团浓度（Critical Micelle Concentration, CMC）时，去垢剂分子会聚集形成微团而改变分子构象，这有可能会影响去污剂的去除效果。小于CMC值时可以去除。