2-8℃

1. 探针-20℃密封避光保存；
2. 避免反复冻融。
3. 注意防止氧化；
4. 试剂拆封后请尽快使用完！

6个月

荧光强度测定；

丝状真菌

1. 广泛适用于各种微生物和特定的 3D 培养物；
2. 简单的“混合-检测”方案允许使用多种其他分析试剂盒进行多参数分析；
3. 可逆转，能够观察耗氧量的瞬态和长时间变化；
4. 可适配多数荧光酶标仪以及标准 96 孔和 384 孔；
5. 以高通量的形式方便地测量；
6. 无需等待专用设备空闲所需的实验室时间，也无需大额资金专用设备投入。

1. 荧光酶标仪
须配备相应的波长过滤器和温度控制器。
2. 离心机
3. 移液器
4. 冰箱
5. 冰盒

1. PBS缓冲液或者HBSS
2. 对照试剂（选配，非必须）：
Glucose Oxidase，

1. 黑色透明底荧光专用培养板
2. 离心管
3. 吸头
4. 一次性手套

1. 螺旋盖微量试剂管装的试剂在开盖前请短暂离心，将盖内壁上的液体收集至管底，避免开盖时液体洒落。
2. 细胞处理需要小心操作,尽量避免人为的损伤细胞。
3. 以下操作以96孔细胞培养板为例。其他培养容器或装置请根据实际情况调整试剂用量和检测方法。各试剂等比例调整即可。O2荧光探针终浓度16倍稀释最佳。
4. BBoxiProbe® R11探针的信号变化直接取决于所测量细胞类型的细胞呼吸速率，建议尽可能使用每孔高的细胞密度作为起点，并根据需要减少细胞数量。
5. 并非所有细胞类型都消耗足够用于检测的氧气。
6. 最好使用荧光培养专用的透明底黑色培养板。实在没有的话可以采用透明板，注意细胞孔间隔开，减少检测时各孔之间的光互相干扰。
7. 用于测定的所有仪器试剂溶液耗材均需37℃预热。
8. 添加氧气封闭液时注意避免产生气泡。
9. 尽可能使用多通道移液器添加试剂。

操作步骤：
注意事项：
25. 以下各个换液、洗涤霉菌的步骤均须注意避免细胞损失。
26. 最好使用培养板离心机离心操作。

1. 检测工作液配制：
用相应的培养基将R11氧荧光探针25倍稀释（例如：96 μL新鲜培养基+ 4 μL BBoxiProbe® R11氧荧光探针），充分混匀。

2. 按下表设定空白孔、对照孔和待测样品孔。
3. 准备细胞模型。
4. 培养好的待检测细胞移除培养基，用PBS洗涤细胞。
5. 加入100 μL新鲜配制的检测工作液。
6. 将培养板置于酶标仪（37℃）或培养箱孵育30 min。
7. （可选，如果需要的话）可以在此处添加待测试化合物（通常为1-10 μL，以实际为准）。
8. 加入药物后立即每孔加入100 μL氧气封闭液。
9. 然后用该细胞板进行荧光细胞外O2消耗变化情况检测。
将培养板置于酶标仪（37℃）中静置5 min后开始检测。
激发波长455 nm - 468 nm，发射波长603 nm。测定荧光强度，每3分钟或5分钟或10分钟读取一次数据。
10. 按照荧光值（F）纵坐标与时间（min）横坐标绘制耗氧率曲线，选择线性部分，按照线性部分的斜率对比细胞的OCR大小。
11. （选做）计算每个样品的斜率值。

如图样本，Sample 2的耗氧率最高，Sample 3的耗氧率最低。
简易计算：
注意事项：
27. 如果各待测样品耗氧率变化线性较好，各样品间差异明显，可以采用以下简易公式快速计算，比较各样本耗氧率差异。
28. 选取线性较好的时间段。

示例：
1. 斜率曲线获得
2. 绘制剂量反应曲线
要生成剂量响应曲线，绘制计算的耗氧率（OCR）与生成如上OCR曲线的数据对应的化合物浓度的关系曲线，
如下：OCR与药物浓度的关系证明化合物A引起对霉菌细胞耗氧的抑制反应。

1. 耗氧率检测趋势跟预期的不一致？
可以从以下方面改善：
检查细胞接种和移液的一致性。
增加细胞密度。
将测定体积减少到60微升。
在某些较短的检测时间区间内，会出现荧光数据的波动情况，出现斜率下降或不变化，需要扩大到更长的时间范围内来分析耗氧率趋势。一般检测时间范围不少于30分钟。
温度对检测有较大影响。有条件的话，务必使用配有温度控制的酶标仪，仪器以及所有培养基和储备溶液均须使用前37℃预热。注意某些读板器的温度控制不一致，如果存在这种情况，请考虑将测定和平衡温度降低到30℃，避开外圈。

2. 使用的细胞类型灵敏度不够？
可以考虑以下改善方案：
增加酶标仪的增益（PMT）设置。
在无酚红或无血清的情况下测定。
增加BBoxiProbe® R11氧荧光探针的体积（至10 μL/孔）。
减少BBoxiProbe® R11氧荧光探针的体积（至2 μL/孔）。
增加细胞密度。
将测定体积减少到60微升。
测量底部读数（如果有）。
调整焦距。

3. 我无法在含有细胞的孔中检测到任何信号，或者我可以检测到信号，但斜率（速率）显得很低？
检查正确的仪器设置，设置信号优化。
增加细胞密度。
将测定体积减少到60微升。

4. 开始测定时荧光强度出现下降趋势？
有些细胞模型样本刚开始测定的一小段时间内可能出现荧光强度下降的情况，一般10分钟左右。可以等荧光平衡后开始上升的时间点作为起点。

1. Yan Zou et al.
Cancer cell-mitochondria hybrid membrane coated Gboxin loaded nanomedicines for glioblastoma treatment
Nature Communications 2023 （IF 17.694）

2. Hongtao Zhu et al.
CRISPRa-based activation of Fgf21 and Fndc5 ameliorates obesity by promoting adipocytes browning
Clinical and Translational Medicine 2023 （IF 11.492）

3. Qi Wu et al.
Glut10 restrains neointima formation by promoting SMCs mtDNA demethylation and improving mitochondrial function
Translational Research 2023 （IF 10.171）

4. Lei Li et al.
Resolvin D1 reprograms energy metabolism to promote microglia to phagocytize neutrophils after ischemic stroke
Cell Reports 2023 （IF 9.995）

5. Jiangang Han et al.
Transcriptome Profiling of Developing Ovine Fat Tail Tissue Reveals an Important Role for MTFP1 in Regulation of Adipogenesis
Frontiers in Cell and Developmental Biology 2022 （IF 6.684）

6. Huijuan Ma et al.
Formaldehyde reinforces pro-inflammatory responses of macrophages through induction of glycolysis
Chemosphere 2021 （IF 8.943）

7. HongGuang Ding et al.
Hypercapnia promotes microglial pyroptosis via inhibiting mitophagy in hypoxemic adult rats
CNS Neuroscience & Therapeutics 2020 （IF 7.035）

8. Jinjin Zhang et al.
Short-Chain Fatty Acids Promote Intracellular Bactericidal Activity in Head Kidney Macrophages From Turbot (Scophthalmus maximus L.) via Hypoxia Inducible Factor-1α
Frontiers in Immunology 2020 （IF 8.786）