2-8℃ 避光

1.探针-20℃密封避光保存；
2.避免反复冻融。
3.注意防止氧化；
4.试剂拆封后请尽快使用完！

6个月

荧光酶标仪

细胞，分离的线粒体等

1.广泛适用于各种体外模型；不再局限于单层细胞，还能测定悬浮细胞、微生物和特定的 3D 培养物；
2.简单的“混合-检测”方案允许使用多种其他分析试剂盒进行多参数分析；
3.可逆转，能够观察耗氧量的瞬态和长时间变化；
4.可适配多数荧光酶标仪以及标准 96 孔和 384 孔；
5.以高通量的形式方便地测量；
6.无需等待专用设备空闲所需的实验室时间，也无需大额资金专用设备投入。

线粒体功能和细胞代谢研究

1.荧光酶标仪
须配备相应的波长过滤器和温度控制器。
2.离心机
3.移液器
4.冰箱
5.冰盒

PBS缓冲液或者HBSS

1.黑色透明底荧光专用96孔培养板
2.离心管
3.吸头
4.一次性手套

1.螺旋盖微量试剂管装的试剂在开盖前请短暂离心，将盖内壁上的液体收集至管底，避免开盖时液体洒落。
2.细胞处理需要小心操作,尽量避免人为的损伤细胞。
3.以下操作以96孔细胞培养板为例。其他培养容器或装置请根据实际情况调整试剂用量和检测方法。各试剂等比例调整即可。O2荧光探针终浓度25倍稀释最佳。
4.BBoxiProbe® R01探针的信号变化直接取决于所测量细胞类型的细胞呼吸速率，建议尽可能使用每孔高的细胞密度作为起点，并根据需要减少细胞数量。
5.并非所有细胞类型都消耗足够用于检测的氧气。
6.必须使用荧光培养专用的透明底黑色培养板，减少检测时各孔之间的光互相干扰。
7.用于测定的所有仪器试剂溶液耗材均需37℃预热。
8.添加氧气封闭液时注意避免产生气泡。
9.尽可能使用多通道移液器添加试剂。
10.如果药物有红色荧光（如阿霉素等）需要换液，不含培养基和待测药物，用HBSS或PBS体系检测，在无血清无酚红环境检测。
11.建议设定FCCP处理的阳性对照样本。

关于仪器设置：
 温度对检测有较大影响。有条件的话，务必使用配有温度控制的酶标仪。
 常规的荧光信号强度测量，使用基于单色仪或基于过滤器的酶标仪，最佳激发波长使用450-460 nm，发射波长使用586-600 nm。可根据实际机器和样本选择信号最强的波长。
 具有检测增益参数（PMT，Parameters）的通常设置为中或高。
 使用bottom read读数和top read读数均可，基于不同的细胞模型，建议在预实验时两种读数模式均尝试下，看哪种的趋势更加明显。

关于氧气封闭液使用：
 氧气封闭液可以用移液器吸取添加，添加时需要沿着培养板壁慢慢加入，使其顺板壁向下流到培养基表面。
 也可以直接用滴瓶滴加，倒转预热的滴管瓶并轻轻施加压力，使封闭液足以充注瓶尖。 每个孔滴两滴，使每个液滴在孔侧面顺应向下流到培养基表面。
 使用移液器添加封闭液时，可将黄色吸头的嘴部用锋利的刀片或剪刀修剪处理。将竖直吸头离尖端3-4 mm处45°角修剪处理。
 取下滴管瓶内嘴盖，轻轻吸取预热的氧气封闭液。避免上下吹吸形成气泡。

关于细胞培养：
 对于贴壁细胞，在200 μL培养基中的96孔板中接种细胞。在37°C的CO2培养箱中孵育过夜。
 对于悬浮细胞，在检测当天在100 μL培养基中接种。
 注意所需的接种密度取决于细胞类型。 我们推荐进行细胞接种密度预实验以确定最佳密度。通常从高细胞密度（通常为60,000）开始，每孔的最佳细胞数一般为：贴壁细胞每孔80,000个细胞，悬浮细胞每孔5-6 x 105（96孔板）。
 检测待测样品都设置3复孔。
 注意始终在每个96孔板上留出至少6个孔，以免添加细胞作为空白对照和信号控制孔。
1. 准备细胞模型。
2. 培养好的待检测细胞移除培养基，用PBS洗涤细胞。
3. 加入100 μL新鲜培养基。
4. 加入4 μL BBoxiProbe® R01氧荧光探针，充分混匀。
5. （可选）可以在此处添加待测试化合物（通常为1-10μL）（如果需要的话）。
6. 每孔加入100 μL氧气封闭液。
7. 然后用该细胞板进行荧光细胞外O2消耗变化情况检测。
激发波长455 nm - 468 nm，发射波长603 nm。测定荧光强度，每2分钟或3分钟读取一次。
8. 绘制耗氧率曲线。
9. 计算每个样品的斜率值。

1.耗氧率检测趋势跟预期的不一致？
可以从以下方面改善：
检查细胞接种和移液的一致性。
增加细胞密度。
将测定体积减少到60微升。
在某些较短的检测时间区间内，会出现荧光数据的波动情况，出现斜率下降或不变化，需要扩大到更长的时间范围内来分析耗氧率趋势。一般检测时间范围不少于30分钟。
温度对检测有较大影响。有条件的话，务必使用配有温度控制的酶标仪，仪器以及所有培养基和储备溶液均须使用前37℃预热。注意某些读板器的温度控制不一致，如果存在这种情况，请考虑将测定和平衡温度降低到30℃，避开外圈。

2.使用的细胞类型灵敏度不够？
可以考虑以下改善方案：
增加酶标仪的增益（PMT）设置。
在无酚红或无血清的情况下测定。
增加BBoxiProbe® R01氧荧光探针的体积（至10 μL/孔）。
减少BBoxiProbe® R01氧荧光探针的体积（至2 μL/孔）。
增加细胞密度。
将测定体积减少到60微升。
测量底部读数（如果有）。
调整焦距。

1.Jinjin Zhang et al.
Short-Chain Fatty Acids Promote Intracellular Bactericidal Activity in Head Kidney Macrophages From Turbot (Scophthalmus maximus L.) via Hypoxia Inducible Factor-1α
Frontiers in Immunology 2020 （IF 7.561）

2.HongGuang Ding et al.
Hypercapnia promotes microglial pyroptosis via inhibiting mitophagy in hypoxemic adult rats
CNS Neuroscience & Therapeutics 2020 （IF 5.243）

3.Huijuan Ma et al.
Formaldehyde reinforces pro-inflammatory responses of macrophages through induction of glycolysis
Chemosphere 2021 （IF 7.086）