2-8℃ 避光

1.试剂B 每次使用前用震荡混匀器剧烈震荡20min
2.所有试剂在使用前均需放置至室温。

3个月

分光光度计

血清、血浆、组织、细胞

分光光度计

1.可见分光光度计
2.恒温水浴锅
3.离心机
4.移液器
5.玻璃比色皿
6.研钵

1.纯水

1.离心管
2.吸头
3.一次性手套

1.试剂A和B 临用前37℃预温后使用；
2.所有试剂在使用前均需放置至室温。
3.试剂B 每次使用前用震荡混匀器剧烈震荡20min

试剂准备：
所有试剂在使用前均需放置至室温。
甲苯100ml 自备
试剂B 每次使用前用震荡混匀器剧烈震荡20min
试剂D 使用前加入3.168ml的甲苯

样本的前处理
1. 血清等液体：直接检测；
2. 组织：按组织重量（g）：试剂A（ml）=1:5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1ml试剂A）进行冰浴匀浆。12000g，4℃离心10分钟，取上清置冰上待测；
3. 细菌、真菌：按细胞数量（104个）：试剂A（ml）=500~1000:1的比例（建议500万细胞加入1ml试剂A），冰浴超声波破碎细胞（功率300w，超声3秒，间隔7秒，总时间3分钟）；然后12000g，4℃离心10分钟，取上清置冰上待测。


LPS测定：
1. 预热分光光度计30min以上，调节波长至710nm，蒸馏水调零；
2. 试剂A和B置于37℃水浴预热30min以上；
3. 在5ml离心管中依次加入下列试剂


37℃振荡反应5min后，静置5min，取800ul上层液加入1ml玻璃比色皿，710nm处测定各管吸光度。

备注：空白管和标准管只需要测定一次。

LPS活性计算：

1.组织、细菌或细胞的LPS活性：
（1）按蛋白浓度计算：
活性单位定义：37℃中每毫克蛋白每分钟水解橄榄油生成1umol脂肪酸为一个酶活力单位；
LPS（umol/min/mg prot）=C标准液 X (A样品-A空白) x V反总 ÷T
A标准-A空白 Cpr x V样

= 16 X A样品-A空白 ÷ Cpr
A标准-A空白
(2)按样本质量计算：
活性单位定义：37℃中每克组织每分钟水解橄榄油生成1umol脂肪酸为一个酶活力单位；
LPS（umol/min/g鲜重）=C标准液 X (A样品-A空白) x V反总 ÷T
A标准-A空白 （W X V样÷V样总）

= 16 X A样品-A空白 ÷ W
A标准-A空白

（3）按细菌或者细胞数量计算：
活性单位定义：37℃中每104个细胞每分钟水解橄榄油生成1umol脂肪酸为一个酶活力单位；
LPS（umol/min/104cell）=C标准液 X (A样品-A空白) x V反总 ÷T
A标准-A空白 （细胞数量x V样÷V样总）

= 16 X A样品-A空白 ÷ 细胞数量
A标准-A空白

2.血清等液体LPS活性的检测：
活性单位定义：37℃中每毫升血清每分钟水解橄榄油生成1umol脂肪酸为一个酶活力单位；
LPS（umol/min/ml）=C标准液 X (A样品-A空白) x V反总 ÷T
A标准-A空白 V样

= 16 X A样品-A空白
A标准-A空白
【注】：
C标准液：10umol/ml；
V反总：反应总体积，2ml；
V样：反应种加入样本体积，0.125ml；
V样总：加入提取液体积，1ml；
Cpr：上清液蛋白浓度，mg/ml；需另外测定，建议用BCA蛋白定量试剂盒；
W：样本质量，g；
T：催化反应时间，10min。