2-8℃ 避光

开盖后组份按要求条件保存。

3个月

微孔板，酶标仪

组织、细胞

微孔板，酶标仪

1.酶标仪
2.离心机
3.振荡器
4.匀浆机/匀浆器
5.涡旋混匀器
6.移液器
7.冰箱

1.纯水
2.蛋白定量试剂盒

1.96孔板
2.吸头
3.一次性手套

1.如果样品浓度过高，可以用蒸馏水稀释后再检测，结果乘以稀释倍数即可。

一、 试剂配制：
1. 用13mL 纯水充分溶解试剂B2，加入5ml试剂试剂B1，充分混匀。配制成试剂B工作液。置于 37℃水浴 10min；用不完的试剂分装后-20℃保存，避免反复冻融；
2. 在试剂C中加入 1mL 纯水，充分溶解，配制成试剂C工作液。用不完的试剂分装后-20℃保存，避免反复冻融。

二、 样本处理：
1. 取50-100mg组织样本，用PBS洗干净，然后用手术剪刀尽可能剪碎，加入200ul SDH提取液，用组织匀浆器/匀浆机匀浆至无明显肉眼可见固体。
【注】：
 细胞样本取5×106 -1×107个细胞，直接加入200ul SDH提取液，用组织匀浆器/匀浆机匀浆。
2. 将匀浆液吸入一预冷的干净离心管中，在4℃条件下振荡10-20分钟。
【注】：
 使用振荡器/摇床的较低转速，提取液能轻微晃动即可。
 没有振荡条件也可以不振荡，稍微延长提取液的处理时间，中间每隔几分钟用移液器吹打混匀即可。
3. 在4℃，8000×g条件下离心5分钟。
4. 取上清待测。

三、 SDH测定
1. 酶标仪预热，调节波长至 600nm，纯水调零。
2. 在96 孔板中加入 10μL 样本、180μL 试剂B和10μL 试剂C，混匀，立即记录 600nm 处 20秒时的吸光值 A1 和 80秒 后的吸光值 A2，计算 ΔA=A1-A2。

四、 计算
1. 按样本蛋白浓度计算
单位的定义：每 mg 组织蛋白每分钟消耗 1 nmol 2,6-二氯酚靛酚定义为一个酶活性单位。
SDH 活性（nmol/min/mg prot）
＝[ΔA×V 反总÷（ε×d）×109]÷(V 样×Cpr) ÷T
=1904×ΔA÷Cpr

2. 按样本鲜重计算
单位的定义：每 g 组织每分钟消耗 1 nmol 2,6-二氯酚靛酚定义为一个酶活性单位
SDH 活性（nmol/min/g 鲜重）
＝[ΔA×V 反总÷（ε×d）×109]÷(W× V 样÷V 样总)÷T
=384×ΔA÷W

3. 按细胞密度计算
单位的定义：每1万个细胞每分钟消耗1 nmol 2,6-二氯酚靛酚定义为一个酶活性单位。
SDH 活性（nmol/min/104cell）
＝[ΔA×V 反总÷（ε×d）×109]÷(500×V 样÷V 样总)÷T
=0.77×ΔA

式中：
V 反总：反应体系总体积，2×10-4L；
ε：2,6-二氯吲哚酚摩尔消光系数，2.1×104L / mol /cm；
d：光径，0.5cm；
V 样：加入样本体积，0.01 mL；
V 样总：加入提取液体积，0.2mL；
T：反应时间，1 min；
Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；
W：样本质量，g；
500：细胞总数，500 万。