2-8℃ 避光

1.长期不用可以-20℃保存。
2.避免反复冻融。
3.试剂拆封后请尽快使用完！

一年

微孔板，酶标仪

血清、血浆、组织

微孔板，酶标仪

1.酶标仪
2.恒温水浴锅
3.离心机
4.移液器
5.冰箱
6.冰盒

1.PBS缓冲液或生理盐水

1.离心管
2.吸头
3.一次性手套

1.待测样品中不能含有磷酸酶抑制剂，同时需避免反复冻融。
2.如果待测样品体积较少，可减少样品加样量，以ACP Assay buffer补至30μl。
3.如果无法检测405nm，亦可检测400～415nm范围内吸光度。
4.建议每次测定时都最好作标准曲线，以使标准更准确，另外标准品避免反复冻融。
5.所测样品的含量高于标准曲线的上限，应用ACP 检测缓冲液稀释样品后重新测定。
6.配制1支显色工作液后应当日用完，因此请注意适当多准备一些样品一起检测。
7.p-nitrophenol溶液对人体有害，反应终止液有腐蚀性，请小心操作。
8.如果希望进行酶活性的绝对定量，进行酶反应时应精确计时，此时推荐采用孵育30min或更长时间，以减小操作过程中的时间误差。
9.待测样品中抗酒石酸酸性磷酸酶活性较低时，可适当延长孵育时间至30min。

样本处理：
1. 血清（浆）样本：血清（浆）直接加样；
【注】：
采血时必须避免溶血；样本2-8℃存放最好当天检测，如来不及可放零度以下冷冻保存，温度越是存放时间越长。
2. 细胞或组织样本；
准确称取待测组织的重量，按重量（g）：体积（ml）=1:9的比例，加入9倍体积的PBS或生理盐水。冰水浴条件下匀浆，制成10%的组织匀浆，3000g，离心10分钟，取上清液进行测定；
一般细胞数量在106以上，组织应在100mg以上。
3. 高活性样品：如果样品中含有较高活性的抗酒石酸酸性磷酸酶，可以使用ACP 检测缓冲液、PBS或生理盐水稀释后再行检测。

试剂配制：
配制显色工作液： 取出1支pNPP，恢复至室温后溶解于2.5ml ACP 检测buffer，混匀，冰上预冷备用，新配制的显色工作液应在6h内用完。
配制系列标准品：取出p-nitrophenol(10mM)恢复至室温，按p-nitrophenol(10mM)：ACP Assay buffer=1：19的比例混合，使浓度达到0.5mM，-20℃冻存备用。按下表继续稀释：

操作步骤：
TRAP加样：按按照下表设置空白孔、标准孔、空白孔，溶液应按照顺序依次加入，并注意避免产生气泡。如果样品中的TRAP活性过高，可以减少样品用量或适当稀释后再进行测定，样品的检测最好能设置平行孔。

轻轻混匀，37℃孵育30min，每孔加入160μl Stopping Solution终止反应。
以空白调零，酶标仪测定405nm处标准管、测定管的吸光度。

系列标准品(1~6号)浓度(即p-nitrophenol含量)50、100、200、300、400、500μM为横坐标，以对应的标准孔吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。
根据测定孔的吸光度在标准曲线上查得待测样品的含量。

计算公式：
单位定义：酸性磷酸酶活性单位的定义：
在pH4.8 37℃条件下，每分钟水解para-nitrophenyl phosphate显色底物产生1微摩尔p-nitrophenol所需的酸性磷酸酶的量定义为一个酶活力单位。根据酶活性定义，计算出样品中的抗酒石酸酸性磷酸酶活性。

1. 血清、血浆中TRACP的计算：

TRACP活力 = 查的的p-nitrophenol含量X 1 X 反应液总体积 X250
（U/ml） 反应时间 取样量
=（查的的p-nitrophenol含量*49*250）/（30*4）

2. 组织中StrACP的计算

TRACP活力 = 查的的p-nitrophenol含量X 1 X 反应液总体积 X250
（U/mgprot） 反应时间 取样量
÷待测样本蛋白浓度 （mgprot/mL）
=（查的的p-nitrophenol含量*49*250）/（30*4）÷待测样本蛋白浓度 （mgprot/mL）