贝博® BBcellProbe® 总巯基检测试剂盒是利用经典的Ellman法进行总巯基检测的试剂盒。试剂盒准确性高,重复性和抗干扰性强,使用方便,可用于测各种蛋白质、抗体等液体样本。 本试剂盒用于测定蛋白质中的总半胱氨酸巯基,如果需要测定游离巯基,可以选择贝博其它货号的试剂盒(相关产品:BB-472422)。 生物体内活性巯基(SH)主要包括谷胱甘肽巯基和蛋白质巯基。谷胱甘肽巯基能够修复氧化损伤的蛋白质,参与活性氧清除。蛋白质巯基主要存在于半胱氨酸,是蛋白质结构和生物体内某些氧化还原反应重要基团,在蛋白质结构中2个巯基脱氢而形成的双硫键,使相邻多肽得以连接.对于维持蛋白质完整结构作用十分重要。 巯基还是很多酶的活性基团,一些重金属盐如Hg2+等与酶巯基结合,影响酶活性。巯基化合物与机体许多机能活动,药物及毒物的作用以及某些疾病的发生发展有着密切关系。 所有动物组织都含有不同量的活性巯基,测定组织和血液中巯基含量已日益为人们所重视,以期探索对某些疾病的发生机理、治疗、预防以及预后判断等方面的研究意义。 贝博® BBcellProbe® 可以提供各种细胞分析试剂盒。包括细胞凋亡、活性、增殖、毒性、活性氧、周期、细胞代谢、氧化应激、膜流动性、膜电位、膜通透性转换孔、细胞耗氧率、胞外酸化、细胞内pH、细胞粘附、细胞自噬等数百种细胞检测试剂盒产品。 贝博® BBcellProbe® 可以为您提供各种细胞成像、细胞示踪与追踪试剂盒产品。包括各种颜色的BBcellProbe® M系列、N系列、L系列、E系列、G系列等细胞膜、细胞质、细胞核、溶酶体、线粒体、内质网、高尔基体、骨架、微管等细胞、细胞亚结构荧光染色试剂盒产品,以及钙离子、钠离子、氩离子等各种荧光染色试剂盒产品。 贝博® BBcellProbe® 可以提供动物、植物、微生物、酵母、水产、家禽、兽类、土壤等样本的各种生化指标检测的数百种试剂盒产品。 贝博® BBcellProbe® 可以提供各种细胞、组织染色,免疫组织化学,细胞培养等相关试剂盒产品。
2.试剂A低温保存后可能会有结晶析出,可以置室温摇匀溶解或者37℃水浴溶解摇匀。
2.恒温水浴锅
3.涡旋混匀器
4.移液器
5.冰箱
6.冰盒
2.纯水
3.蛋白定量试剂盒
2.试管
3.吸头
4.一次性手套
2.试剂B2干粉开盖使用前先敲入瓶底部,防止开盖时洒落导致损失。
3.试剂C2干粉开盖使用前先敲入瓶底部,防止开盖时洒落导致损失
1. 使用前,准确吸取10 ml试剂B1加入试剂B2干粉,充分溶解混匀,即成试剂B工作液,4℃避光保存备用。
2. 使用前,准确吸取10 ml试剂C1加入试剂C2干粉,充分溶解混匀,即成试剂C工作液,4℃避光保存备用。
【注】:
一次用不完的试剂工作液可以根据实验需要分装后-20℃冻存。
样本处理:
1. 蛋白质/抗体等液体样本:直接检测或稀释后检测。
检测前进行蛋白浓度测定(mg/ml,g/L)。
2. 固体粉末用试剂A溶解后测定。蛋白浓度范围在1-10mg/ml均可。
进行蛋白浓度测定(mg/ml,g/L)。
总巯基的测定
1. 待测蛋白样品100 μl加入700 μl试剂A,充分混匀,室温或37℃静置1-4小时。
2. 再加入100 μl试剂B工作液,充分混匀,在室温或37℃静置10-30分钟。
3. 加入100 μl试剂D,充分混匀。
4. 冰浴或4℃冰箱静置30分钟以上。
【注】:
可以4℃静置过夜。
5. 在4℃,12000×g以上条件下离心10分钟。
6. 小心移除上层清液丢弃,留沉淀。
【注】:
尽可能吸干液体,小心不要吸走沉淀。
7. 加入100 μl试剂E到离心管中,洗涤沉淀。在4℃,12000×g条件下离心10分钟。小心移除弃上清,留沉淀。
【注】:
重复此步骤两次。
尽可能吸干液体,小心不要吸走沉淀。
8. 用900 μl试剂F溶解沉淀。
【注】:
用移液器充分吹打混匀。
沉淀不好溶解时可以超声助溶。
9. 加入100 μl试剂C工作液,充分混匀。
10. 置室温静置10分钟。412 nm,0.5 cm光径,测定OD值。
巯基含量计算:
总半胱氨酸巯基含量(mmol/g ;mmol-SH/g-Protein)
= 测定吸光度÷14.15÷0.5×10÷蛋白含量(g/L)
【注】:
以上以0.5cm光径检测设备为例,如果实际使用的检测设备是采用1cm光径,将计算公式中的0.5换成1即可。
【注】:
14.15 mM/cm为毫摩尔消光系数;
0.5 cm为光径;
10 为反应总体积/样品取样量
可能是样品中的游离巯基已经被氧化。
需要最大限度地减少样品制备与分析之间的时间间隔,尽快完成分析测定。可以在样品中加入1-5 mM 的EDTA以螯合可能氧化巯基的二价金属离子。
2.需要绘制标准曲线吗?
由于Ellman反应的显色产物摩尔消光系数高且稳定,因此可以不必绘制标准曲线,直接通过摩尔消光系数计算即可。
如果需要可以选择贝博其它含有标准品的试剂盒(相关产品:BB-472462或者BB-472463)。
如果需要自行绘制标准曲线,可以使用半胱氨酸盐酸盐一水合物(CAS#:7048-04-6 MW=175.63)做标准品,用反应缓冲液配制1.5 mM的标准品,然后分别稀释成1.25 mM、1.0 mM、0.75 mM、0.5 mM、0.25 mM、0.125 mM、0 mM等不同浓度的标准品。取900 μl加入100 μl试剂C工作液,充分混匀。置室温静置10分钟。412 nm,测定OD值。
Effect of chirality of cysteine on the cell growth and photo-fermentative hydrogen production by using acetate as substrate
Fuel 2021 (IF=6.609)
2.Yan Yan et al.
Nanosized functional miRNA liposomes and application in the treatment of TNBC by silencing Slug gene
International Journal of Nanomedicine 2019 (IF=6.400)
3.HanQuanWen et al.
Enhanced photo-fermentative hydrogen production by synergistic effects of formed biofilm and added L-cysteine
Renewable Energy 2019 (IF=8.001)
4.MengGe Sun et al.
Targeting Epirubicin Plus Quinacrine Liposomes Modified with DSPE-PEG2000-C(RGDfK) Conjugate for Eliminating Invasive Breast Cancer
Journal of Biomedical Nanotechnology 2015 (IF=5.068)
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