2-8℃ 避光

开盖后组份按要求条件保存。

3个月

微孔板，酶标仪

组织、细胞样本

微孔板，酶标仪

1.酶标仪
2.恒温水浴锅
3.离心机
4.移液器
5.钵体

1.双蒸水
2.冰

1.一次性手套
2.96孔板

1.螺旋盖微量试剂管装的试剂在开盖前请短暂离心，将盖内壁上的液体收集至管底，避免开盖时液体损失导致试剂量不够用。
2.正式测定前务必取 2-3 个预期差异较大的样本做预测定;
3.由于每一个样都必须做对照，本试剂盒 100 管只能测 48 份 Ca++ Mg++ -ATP 酶。
4.此法具有微量、灵敏、快速的特点。所以对测定所用试管要求严格无磷。避免磷污染是 检测成败的关键。
5.空白管和标准管只要做一管。

试剂工作液配制 ：
1. 试剂C的配制：
临用前粉剂C加入 6mL 双蒸水充分混匀待用；用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融。
2. 试剂E的配制：
用时粉剂E加入 3mL 双蒸水， 4℃保存。
3. 试剂F的配制：
用时粉剂F加入 25mL 双蒸水，溶解后 4℃保存一周。
4. 试剂G的配制：
用时粉剂G加入 25mL 双蒸水，溶解后 4℃保存一周。
5. 0.5μmol/mL 标准磷应用液配制：
将试剂I 用双蒸水20 倍稀释，即取 0.1mL 试剂I加 1.9mL 双蒸水 充分混匀。
6. 定磷剂的配制：
按 双蒸水: 试剂F:试剂G:试剂H=2:1:1:1 的比例配制，配好的定磷剂应为浅黄色。（若无色则试剂失效，若是蓝色则为磷污染，定磷剂现用现配。）

【注】：
配试剂最好用新的烧杯、玻棒和玻璃移液器，也可以用一次性塑料器皿，避免磷污染。

样品的前处理：
1. 细菌、细胞样品的制备：
细菌或培养细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量（104个）：提取液体积（mL）为 500~1000：1 的比例（建议 500 万细菌或细胞加入 1mL 提取液A），超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率 20％或 200W，超声 3s，间隔 10s，重复 30 次）； 8000g 4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。
2. 组织样品的制备：
按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为 1：5~10 的比例（建议称取约 0.1g 组织， 加入 1mL 提取液A），进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。
3. 血清（浆）样品：直接检测。

操作步骤：
1. 酶标仪预热 30min 以上，调节波长至 660nm，双蒸水调零。

2. 酶促反应（在 EP 管中加入下列试剂）
充分混匀，8000g，25℃离心 10min，取上清液。

3. 定磷（在96 孔板中加入下列试剂）
充分混匀，室温放置 30min，在 660nm 处，记录各管吸光值。

Ca ++ Mg++ - ATPase 活力的计算：
1. 血清（浆）Ca ++ Mg++ - ATPase活力的计算:
定义：每小时每毫升血清（浆）中 Ca++ Mg++ - ATP 酶分解 ATP 产生 1μmol 无机磷的量为一 个酶活力单位。
Ca++ Mg++ -ATP 酶活力（μmol/h/mL）
= [C 标准管×V 总]×（A 测定管-A 对照管）÷（A 标准 管-A 空白管）÷V 样÷T
=7.5×（A 测定管-A 对照管）÷（A 标准管-A 空白管）

2. 组织、细菌或细胞中 Ca++ Mg++ - ATPase 活力的计算：
（1）按蛋白浓度计算：
定义：每小时每毫克组织蛋白中 Ca++ Mg++ - ATP 酶分解 ATP 产生 1μmol 无机磷的量为一个 酶活力单位。

Ca++ Mg++ -ATP 酶活力(μmol/h / mg prot)
= [C 标准管×V 总]×（A 测定管-A 对照管）÷（A 标 准管-A 空白管）÷（V 样×Cpr）÷T =7.5×（A 测定管-A 对照管）÷（A 标准管-A 空白管）÷Cpr

（2）按样本鲜重计算：
定义：每小时每克组织中 Ca++ Mg++ -ATP 酶分解 ATP 产生 1μmol 无机磷的量为一个酶活力 单位。

Ca++ Mg++ -ATP 酶活力(μmol/h /g 鲜重)
=[C 标准管×V 总]×（A 测定管-A 对照管）÷（A 标准 管-A 空白管）÷(W× V 样÷V 样总)÷T
=7.5×（A 测定管-A 对照管）÷（A 标准管-A 空白管）÷W

（3）按细菌或细胞密度计算：
定义：每小时每1万个细菌或细胞中 Ca++ Mg++ -ATP 酶分解 ATP 产生 1μmol 无机磷的量为 一个酶活力单位。

Ca++ Mg++ -ATP 酶活力(μmol/h /104 cell)
= [C 标准管×V 总]×（A 测定管-A 对照管）÷（A 标准管-A 空白管）÷(500×V 样÷V 样总)÷T
=0.015×（A 测定管-A 对照管）÷（A 标准管-A 空白管）

【注】：
C 标准管：标准管浓度，0.5μmol/mL；
V 总：酶促反应总体积，0.25mL；
V 样：加入样本体 积，0.1mL ；
V 样总：加入提取液体积，1mL；
T：反应时间，1/6 小时；
Cpr：样本蛋白质 浓度，mg/mL；
W：样本鲜重，g；
500：细菌或细胞总数，500 万。