2-8℃ 避光

开盖后组份按要求条件保存。

6个月

微孔板，酶标仪

微孔板，酶标仪

1.酶标仪
2.恒温水浴锅
3.台式离心机
4.漩涡混匀器
5.移液器

1.纯水
2.蛋白定量试剂盒

1.96孔板
2.吸头
3.一次性手套
4.铝箔

1.预实验很重要。必须要做预实验，在正式实验之前取少量样本优化实验条件，并像正式样本一样认真进行，看实验结果是否可行，实验条件是否适合自己的样本。由于生物样本的多样性，不同样本的实验条件通常差异较大，同种细胞的不同模型下需要的实验条件也可能不同，为了避免浪费正式样本和试剂，一定要提前预实验优化实验条件。
2.试剂B、试剂C和试剂D均需避光保存。
3.试剂D变蓝绿色后不能再使用。
4.加入试剂D后必须立即混匀，否则显色不完全。
5.正式测定之前选择 2-3 个预期差异大的样本做预测定。

样本的前处理：
1. 组织：按照组织质量（g）：试剂A体积(mL)为 1：5~10 的比例（建议称取约 0.1g 组织， 加入 1mL 试剂A）进行冰浴匀浆，4℃、8000g 离心 10min，取上清液待测。

2. 细菌或细胞：按照细菌或细胞数量（104个）：试剂A体积（mL）为 500~1000：1 的比例 （建议 500 万细胞加入 1mL 试剂A），冰浴超声波破碎细胞（功率 300w，超声 3 秒，间 隔 7 秒，总时间 3min）；然后 8000g，4℃，离心 10min，取上清置于冰上待测。

3. 血液可直接测定，或者适当稀释后测定。

操作步骤：
1. 酶标仪预热 30 min，调节波长到 510 nm，纯水调零。
2. 试剂C置于 37℃水浴中预热 30 min。
3. 空白孔：
加入 4 μL 纯水，40 μL 试剂B，40 μL 试剂C，混匀后置于 37℃保温15 min；加入试剂D 120 μL，混匀后于 510 nm 测定吸光度，记为 A 空白管。
4. 标准孔：
加入 4 μL 标准品，40 μL 试剂B，40 μL 试剂C，混匀后置于 37℃保温15 min；加入试剂D 120 μL，混匀后于 510 nm 测定吸光度，记为 A 标准管。
5. 对照孔：
加入 4 μL 上清液，40 μL纯水，40 μL 试剂C，混匀后置于 37℃保温15 min；加入试剂D 120 μL，混匀后于 510 nm 测定吸光度，记为 A 测定管。
6. 测定孔：
加入 4 μL 上清液，40 μL 试剂B，40 μL 试剂C，混匀后置于 37℃保温15 min；加入试剂D 120 μL，混匀后于 510 nm 测定吸光度，记为 A 测定管。

其中标准孔和空白孔只需做一孔，测定孔和对照孔每个样均需做。

计算公式：
1. 血液中 AKP/ALP 活力计算
活性单位定义：37℃中每毫升血液每分钟催化产生 1 μmol 酚定义为 1 个酶活单位.
AKP/ALP 活力(μmol/min /mL)
= [C 标准品×(A 测定孔-A 对照孔)÷(A 标准孔-A 空白孔)×V 反 总] ÷V 样÷T
=6.8×(A 测定孔-A 对照孔)÷(A 标准孔-A 空白孔)

2. 组织、细菌或细胞中 AKP/ALP 活性计算
（1） 按照蛋白浓度计算
活性单位定义：37℃中每毫克蛋白每分钟催化产生 1 μmol 酚定义为 1 个酶活单位。
AKP/ALP(μmol/min/mg prot)=[C 标准品×(A 测定孔-A 对照孔)÷(A 标准孔-A 空白孔)×V 反 总]÷(Cpr×V 样)÷T
=6.8×(A 测定孔-A 对照孔)÷(A 标准孔-A 空白孔) ÷Cpr

（2） 按照样本质量计算
活性单位定义：37℃中每克组织每分钟催化产生 1 μ mol 酚定义为 1 个酶活单位。
AKP/ALP(μmol/min/g 鲜重)
=[C 标准品×(A 测定孔-A 对照孔)÷(A 标准孔-A 空白孔)×V 反 总]÷(W×V 样÷V 样总)÷T
=6.8×(A 测定孔-A 对照孔)÷(A 标准孔-A 空白孔) ÷W

（3） 按照细菌或细胞数量计算
活性单位定义：37℃中每 104个细菌或细胞每分钟催化产生 1 μ mol 酚定义为 1 个酶活单位。
AKP/ALP (μmol/min/104 cell)
= [C 标准品×(A 测定孔-A 对照孔)÷(A 标准孔-A 空白孔)×V 反 总]÷(细胞数量×V 样÷V 样总)÷T
= 6.8×(A 测定孔-A 对照孔)÷(A 标准孔-A 空白孔) ÷细胞数量

C 标准品：2 μmol/mL；
V 反总：反应体系总体积（mL），205 μL=0.205 mL；
Cpr：样本蛋白质浓度（mg/mL），需要另外测定，建议使用BCA 蛋白质含量测定试剂盒；
W：样品质量；
V 样：加入反应体系中上清液体积（mL），0.004 mL；
V 样总：提取液体积， 1 mL；
T：反应时间（min），15 min。

1.Jingqi Zheng et al.
Preparation of bioactive hydroxyapatite@halloysite and its effect on MC3T3-E1 osteogenic differentiation of chitosan film
Materials Science & Engineering C-Materials for Biological Applications 2019

2.Xinxin Zhang et al.
Reactive incorporation of Ag into porous TiO2 coating and its influence on its microstructure, in vitro antibacterial efficacy and cytocompatibility
Progress in Natural Science-Materials International 2021