2-8℃ 避光

开盖后组份按要求条件保存。

一年

微孔板，酶标仪

血清血浆/组织/细胞

1.本试剂盒中试剂均无刺激性气味，对操作人员无任何毒害。
2.快速准确，操作简便，每小时可测100例以上样本。
3.灵敏度高，血清或血浆样品只需0.1 ml，或者更少。
4.再现性好，变异系数CV=1.5%，同一份标本数次测试结果相关极微。
5.呈色稳定，呈色后一天内测吸光度不变。
6.血清样品放置40℃，3~5天内测试结果不变。—70℃以下可保存个月至半年。
7.测试面广，可测血清、血浆、各种组织匀浆，培养细胞等。
8.不需昂贵与特殊仪器，只需恒温水浴箱或铝锅、铝盆开盖煮沸，及721、722、751、752分光光度计任一型号均可。
9.稳定，不受气温等外界因素的影响。

微孔板，酶标仪

1.酶标仪
2.恒温水浴锅
3.离心机
4.移液器
5.冰箱
6.冰盒

1.生理盐水
2.双蒸水
3.PBS缓冲液
4.蛋白定量试剂盒

1.离心管
2.吸头
3.一次性手套
4.96孔板

1.必须使用干净的试管。
2.配制试剂时要充分混匀，加样或加试剂时要垂直加入试剂中，避免加到管壁。
3.水浴时间和温度必须固定。
4.血浆、血清或尿液样品制备后可以直接用于MDA测定。
5.组织或细胞可以使用PBS或裂解液进行匀浆或裂解。对于组织，组织重量占匀浆液或裂解液的比例为10%；对于细胞，每100万细胞使用0.1ml裂解液或匀浆液。匀浆或裂解后，1600g离心10分钟取上清用于后续测定。匀浆或裂解等样品制备步骤宜在冰浴或4℃进行操作。
6.对于组织或细胞样品，样品准备完毕后可以用BCA蛋白浓度测定试剂盒测定蛋白浓度，以便于后续计算单位蛋白重量组织或细胞内的MDA含量。
7.95℃水浴最好用带盖试管，如无带盖试管，可用保鲜膜扎口，水浴时用针扎一小孔。
8.试剂A温度低时会凝固，使用前水浴加热溶解至透明。
9.测定样品吸光度值较低时，可将水浴延长至80min，但应同时延长，以免造成批间差异。
10.避免使用EDTA、枸橼酸、氟化钠、草酸等抗凝剂。
11.待测样本如不能及时测定，应置于-20℃保存，4天内稳定。

样品测定：
1. 样品处理
①血清、血浆、尿液、脑脊液样本：从待测样本中分理出的血清或血浆不应有溶血，直接检测，如超过线性范围，用生理盐水或者PBS稀释后检测。
②组织、细胞等样本：组织或细胞可以使用PBS或贝博的RIPA裂解液（BB-3201）等进行匀浆或裂解。
匀浆或裂解组织时，组织重量占匀浆液或裂解液的比例应为10%；
对于细胞，每106 个细胞使用0.1 ml裂解液或匀浆液。匀浆或裂解后，1600×g离心10 min，取上清用于后续测定。
匀浆或裂解等样品制备步骤宜在冰浴或4℃进行操作。
样品准备完毕后可以用BCA蛋白浓度测定试剂盒测定蛋白浓度，以便于后续计算单位蛋白重量组织或细胞内的MDA含量。

2. 试剂配制：
TBA工作液的配制： 称取适量TBA，用TBA稀释液配制成浓度为0.68%的TBA工作液。TBA工作液需完全溶解后再使用，可以加热到60－70℃促溶，并可通过反复剧烈Vortex促溶。
配制好的TBA工作液4℃避光保存，1个月内有效。

3. 稀释标准品：
取适量MDA标准品（1mM）用恰当溶液稀释至1、2、5、10、20、50 μM（如果进行简易快速检测，标准品直接稀释10 μM）。

4. MDA检测工作液的配制：临检测前，根据待测定的样品数(含对照)，参考下表新鲜配制适量的MDA检测工作液。
5. 样品测定:
离心管或其它适当容器内加入0.1 ml匀浆液、裂解液、PBS、生理盐水等适当溶液作为空白对照。加入0.1 ml 上述不同浓度标准品用于制作标准曲线，加入0.1 ml样品用于测定；随后加入4.14 ml MDA检测工作液。

在带盖试管中按下表配制检测反应体系：

6. 混匀, 加盖，95℃水浴煮沸40 min，加热时务必注意避免液体暴沸溅出。如果使用加热块(Heat block)进行加热注意用重物压紧离心管盖；如果使用沸水浴，则需使用可把盖子锁死的离心管或螺旋盖离心管，或用Parafilm封住离心管口，用针头刺一小孔。最方便和准确的加热方法是使用带有热盖并可以加热金属浴。
7. 水浴或流水冷却至室温。
8. 在3000×g离心15分钟或4000×g离心10分钟。
9. 取上清，双蒸水调零，用酶标仪检测535 nm处吸光值。96孔板每孔加200 μl上清液。分别记为A空白、A标准、A样品。

结果计算：
对于血浆、血清或尿液等样品可以直接根据标准曲线计算；也可以简易快速检测方法，采用如果进行简易快速检测，直接以10 μM标准品进行计算，获得MDA的摩尔浓度。
对于细胞、或组织样品，计算出样品溶液中的MDA含量后，可以通过单位重量的蛋白含量或组织重量等来表示最初样品中的MDA含量，例如μmol/g蛋白或组织。

简易快速血清、血浆、尿液等液体样品中MDA含量计算公式：
血清中MDA含量（μmol/L）
=（A样品-A空白）÷（A标准-A空白）×10 × 样品测试前稀释倍数

简易快速细胞、组织样品中MDA含量计算公式：
组织细胞中MDA含量（μmol/g）
=（A样品-A空白）÷（A标准-A空白）× 10 ÷ 样品蛋白浓度（mg/ml）

式中：
A样品=样品孔的吸光度
A标准=标准孔的吸光度
A空白=空白孔的吸光度


参考区间：
健康成年人血清MDA：9.58±2.15 μmol/L 血浆MDA：7.31±1.27 μmol/L

参考取样量：
血清（浆）尿液取0.1 ml；
低密度脂蛋白悬液取0.1~0.2 ml。
食用油取0.03 ml；
细胞悬液细胞上清0.1~0.2 ml。
肝组织、心肌、肌肉组织等，取5%或10%匀浆0.1~0.2 ml较好。