

贝博TM BBcellProbe® 植物丙二醛(MDA)检测试剂盒(TBA比色法)(Plant MDA Assay Kit with TBA)又称脂质氧化(MDA)检测试剂盒,是采用一种基于MDA和硫代巴比妥酸(thiobarbituric acid, TBA)反应产生红色产物的显色反应,随后通过比色法用于对植物组织(根、茎、叶、种子等)MDA进行检测,是专门用于植物脂质氧化(lipid peroxidation)水平检测的试剂盒,不适用于动物组织、细胞、血液等。
丙二醛在较高温度及酸性环境中可与TBA发生反应,形成红色的MDA-TBA加合物,MDA-TBA加合物在532nm处有最大吸收,该复合物的吸光系数为155mmol/(L.cm),并且在600nm波长处有最小吸收。植物组织中糖类物质对MDA-TBA反应有干扰,我们总结出经验公式,以消除这一干扰。亦可以通过比标准品进行比较,进行含量检测。
动物或植物细胞发生氧化应激(oxidative stress)时,会发生脂质氧化。机体通过酶系统与非酶系统产生氧自由基,后者能攻击生物膜中的多不饱和脂肪酸,引发脂质过氧化作用,并因此形成脂质过氧化物。如:醛基(丙二醛MDA)、酮基、羟基、羰基、氢过氧基或内过氧基,以及新的氧自由基等。脂质过氧化作用不仅把活性氧转化成活性化学剂,即非自由基性的脂类分解产物,而且通过链式或链式支链反应,放大活性氧的作用。因此,初始的一个活性氧能导致很多脂类分解产物的形成,这些分解产物中,一些是无害的,另一些则能引起细胞代谢及功能障碍,甚至死亡。氧自由基不但通过生物膜中多不饱和脂肪酸的过氧化引起细胞损伤,而且还能通过脂氢过氧化物的分解产物引起细胞损伤。
丙二醛(Malondialdehyde, MDA)作为这种生物体脂质氧化的天然产物,脂肪酸氧化后逐渐分解为一系列包括MDA在内的复杂化合物,因而测试 MDA的量常常可反映机体内脂质过氧化的程度,间接地反映出细胞损伤的程度,通过检测MDA的水平检测脂质氧化的水平, MDA的测定可以被广泛用作脂质氧化的指标。
生物体内的一些其它生化反应也会产生MDA,例如thromboxane synthase也可以催化产生,但只要在测定时设置适当对照即可观察到脂质氧化水平的变化。
MDA的测定常常与SOD的测定相互配合,SOD活力的高低间接反应了机体清除氧自由基的能力,而MDA的高低又间接反应了机体细胞受自由基攻击的严重程度,通过SOD与MDA的结果分析有助于农业生产的发展。
贝博TM BBcellProbe® 可以提供细胞凋亡、增殖、毒性、活性氧、细胞代谢、氧化应激、细胞膜流动性、膜通透性转换孔、细胞耗氧率、细胞内pH、细胞粘附、细胞自噬等数百种检测试剂盒产品。
贝博TM BBcellProbe® 可以为您提供各种颜色的BBcellProbeTM M系列、N系列、L系列、E系列、G系列等细胞膜、细胞质、细胞核、溶酶体、线粒体、内质网、高尔基体、骨架、微管等细胞、细胞亚结构荧光染色试剂盒产品,以及钙离子、钠离子、氩离子等各种荧光染色试剂盒产品。
2. 快速准确,操作简便,每小时可测100例以上样本。
3. 灵敏度高,要求的最少样本量少。
4. 再现性好,变异系数CV=1.5%,同一份标本数次测试结果相关极微。
5. 呈色稳定,呈色后一天内测吸光度不变。
6. 不需昂贵与特殊仪器,只需恒温水浴箱或铝锅、铝盆开盖煮沸,及721、722、751、752分光光度计任一型号均可。
7. 稳定,不受气温等外界因素的影响。
2. 恒温水浴锅/恒温箱
3. 离心机
4. 涡旋混匀器
5. 移液器
6. 剪刀
2.BCA蛋白定量试剂盒
2.离心管/小试管
2. 待测提取液如果不能及时测定,应置于-20℃,4天内稳定。
3. 待测样品尽量新鲜,提取后应尽快检测,以免活性下降。
1. 制备提取液:
取适量的植物根、茎、叶子、种子等,称量后剪碎,按每0.4g植物样品加入4ml的比例加入组织匀浆液,充分匀浆(一般取0.4~1g植物样品即可)。4000g离心10min,取上清液待用,该上清液即为MDA提取液。
2. 样品准备完毕后可以用BCA蛋白浓度测定试剂盒测定蛋白浓度,以便于后续计算单位蛋白重量植物样品的MDA含量。
试剂的配制:
1. TBA工作液的配制:
称取适量TBA,用组织匀浆液配制成浓度为0.68%的TBA工作液。
例如取0.068g TBA用10ml组织匀浆液配制,最终浓度即为0.68%的TBA工作液。TBA工作液需完全溶解后再使用,可以加热到60℃促溶,并可通过反复剧烈Vortex促溶。
配制好的TBA工作液4℃避光保存,至少1个月内有效。
2. 稀释MDA标准品:
取适量标准品用组织匀浆液稀释至1、2、5、10、20、50μM;
如果进行简易快速检测,标准品直接稀释10μM,
如果采用经验公式计算含量,无需标准品。
配制好的MDA标准品4℃避光保存,至少3个月内有效。
样品测定:
1. 在离心管或其他适当容器内加入1ml组织匀浆液作为空白对照,加入1ml提取液用于测定,随后加入1ml TBA工作液。
可参考下表设置检测反应体系,依次加入试剂:
2. 混匀,加盖,95℃水浴煮沸30min。
3. 流水冷却至室温,4000g离心10min;
4. 取上清,蒸馏水调零,用分光光度计检测532nm处吸光度。
计算:
如果进行简易快速检测,直接以10uM标准品进行计算,获得MDA的摩尔浓度;
如果采用经验公式,无需制作标准曲线或测定标准品。
如果需要精确计算,以MDA标准品浓度为横坐标,以对应的吸光度为纵坐标,制作标准曲线,根据标准曲线计算MDA提取液的浓度;
对于固体状组织,可以通过单位重量的蛋白含量或组织重量等来表示最初样品中的MDA含量,例如umol/mg蛋白或umol/mg组织。
简易快速MDA含量计算公式:
MDA含量(umol/mg)
=(A样品-A空白)/(A标准-A空白)x 标准品浓度/提取物蛋白浓度(mgml)
其中:
A样品为待测样品的532nm处吸光度;
A标准为标准品的532nm处吸光度;
A空白为空白对照的532nm处吸光度。
标准品浓度=10uM
不采用标准品的经验公式:
MDA浓度(umol/L)=6.45 x(A532-A600)-0.56 xA450
MDA含量(umol/mg)= MDA浓度(umol/L) x 提取液体积(ml)/植物组织鲜重(g)
其中:
A532为待测样品在532nm处的吸光度;
A600为待测样品在600nm处的吸光度;
A450为待测样品在450nm处的吸光度。
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