-20℃ 避光保存。

1.探针长期不用可以-20℃保存。
2.避免反复冻融。
3.可以根据需要分装后冻存。
4.染色液A为DMSO溶液，冬季气温较低时为凝固状态，极易粘附在管壁、吸头壁。注意需要加热融解，变成液体状态后离心至管底部再开盖。
5.可以用手捂住使其融解或37℃短时间水浴。吸头也需要放在培养箱预热，否者容易再次凝固在吸头内壁产生损耗。
6.试剂拆封后请尽快使用完！

6个月

1.荧光分光光度计
2.荧光酶标仪
3.流式细胞仪
4.荧光显微镜
5.激光共聚焦

1.悬浮细胞2.贴壁细胞

1.使用方便：可用荧光分光光度计、荧光酶标仪或流式细胞仪检测或激光共聚焦显微镜直接拍照分析；
2.背景低，灵敏度高；
3.线性范围宽，使用方便。

1.荧光分光光度计
2.荧光酶标仪
3.流式细胞仪
4.荧光显微镜
5.激光共聚焦

1.荧光分光光度计或荧光酶标仪，
流式细胞仪、激光共聚焦、荧光显微镜等
2.离心机
3.移液器
4.冰箱
5.冰盒

BS缓冲液 （pH7.4，实验室常用的10mM磷酸缓冲盐溶液（1X）） （phosphate buffer saline/Dulbecco’s PBS：约含8mM Na2HPO4、2mM KH2PO4、137mM NaCl和3mM KCl）
 或者HBSS（Hank's Balanced Salt Solution； With：Calcium Magnesium Glucose； Without：Phenol Red。Components：CaCl2(anhydrous) 140mg/L(1.261mM)、MgCl2-6H2O 100mg/L(0.493mM)、MgSO4-7H2O 100mg/L(0.407mM)、KCl 400mg/L (5.333mM)、KH2PO4 60mg/L(0.441mM)、NaHCO3 350mg/L(4.167mM)、NaCl 8000mg/L(137.931mM)、Na2HPO4(anhydrous) 48mg/L(0.338mM)、D-Glucose 1000mg/L(5.556mM)）

1.离心管
2.吸头
3.黑色96孔板
4.一次性手套

1.螺旋盖微量试剂管装的试剂在开盖前请短暂离心，将盖内壁上的液体收集至管底，避免开盖时液体洒落。
2.荧光探针标记后，一定要洗净残余的未进入细胞内的探针，否则会导致背景较高。
3.探针标记完毕并洗净残余探针后，可以进行激发波长的扫描和发射波长的扫描，以确认探针的标记情况是否正常。
4.尽量缩短探针标记后到测定所用的时间，以减少各种可能的误差。
5.对于药物作用时间较短(2小时以内)的细胞，先标记探针，后用药物刺激细胞。对于药物作用时间较长(6小时以上)的细胞，先用活性氧阳性对照诱导剂或相应的药物刺激细胞，后标记探针。
6.DHR在光照和空气中易被氧化，注意避光密封保存。
7.对不同的细胞和组织，应选择合适的孵育时间和浓度，以观察ROS的变化，很多细胞内的ROS绝对水平较低，需要根据实际情况适当延长孵育时间。
8.DHR探针可以根据需要的用量分装后冻存，避免反复冻融。
9.DHR不可以一次性全部稀释后长期保存不用，稀释后稳定性变差，有效期缩短。

DHR探针配制：
1. DHR探针可在新鲜无血清培养基、各种缓冲盐溶液中稀释到所需浓度，500-1000倍稀释，以此染色工作液更换细胞培养基；也可直接向细胞培养基中加入DHR探针溶液至所需浓度。
2. 依据细胞ROS含量的不同，DHR终浓度可选择在500-1000倍稀释的范围，孵育时间可选择20-120 分钟，在37℃或室温进行避光孵育。

DHR探针标记：
原位标记：仅适用于贴壁培养细胞。
1. 按照1:500-1000用无血清培养基稀释BBoxiProbe® DHR探针。
2. 去除细胞培养基，用PBS洗细胞一次。
3. 加入适当体积稀释好的BBoxiProbe® DHR探针。加入的体积以能充分盖住细胞为宜，通常对于96孔板每孔加入100-200μl染色液，六孔板的一个孔加入稀释好的BBoxiProbe® DHR探针不少于1毫升。
4. 在37℃细胞培养箱内避光孵育20-120分钟。
5. 用无血清细胞培养液洗涤细胞三次，以充分去除未进入细胞内的BBoxiProbe® DHR探针。


收集后标记：悬浮细胞或贴壁细胞消化处理
1. 按照1:1000用无血清培养基稀释BBoxiProbe® DHR探针。
2. 离心移除培养基，用PBS洗细胞一次。
3. 细胞收集后悬浮于稀释好的BBoxiProbe® DHR探针中，细胞浓度为1*106-2*107/毫升，37℃细胞培养箱内避光孵育20-120分钟。每隔3-5分钟颠倒混匀一下，使探针和细胞充分接触。
4. 用无血清细胞培养基洗涤细胞三次，以充分去除未进入细胞内的BBoxiProbe® DHR探针。
5. 用无血清细胞培养基重悬细胞。

荧光显微镜检测：
1. 对贴壁生长细胞，可直接在荧光显微镜下观察；对悬浮生长细胞，取25-50μl细胞悬液滴到一张显微载玻片上，再盖上一张盖玻片。
2. 荧光显微镜下，用蓝光激发，观察和拍摄细胞绿色发射图像，ROS阳性细胞在整个核区被染成绿色。

流式细胞仪分析：
1. 对贴壁生长细胞，用胰酶消化制备成单细胞悬液；对悬浮生长细胞，直接收集细胞。用0.5~1 ml冰冷PBS重悬细胞（5~10万）。
2. 采用488nm波长激发，测定待测细胞平均荧光强度。

1.活性氧结果如何分析？
ROS是多种物质的统称，不像某一单一活性氧指标，无法检测其绝对的含量，只能通过设置参照样本，以参照样本的倍数来反映目标样本相对含量变化，这个“相对”是针对参照的。分析结果是定性的，也是没有单位的，因为它本质上是一个比值（目标/参照）。反映的是模型样本通过具体的干预措施（如养分缺失、缺氧、药物治疗或遗传基因操控等）如何影响其ROS的变化，测定其ROS是增加或者降低了。

2.荧光照片如何分析？
需要有相关的荧光强度分析软件。ROS表达水平直接通过荧光信号的强弱和分布范围来体现。
有的显微镜扫描下来的图像本身就可以测面积和强度，可以同时测不同颜色的荧光强度。有的显微镜不支持此功能，可以将荧光染色彩色图像转换为黑白的灰度图，然后再以灰度值作为测量指标进行分析。
要结合明场的照片具体分析。如果细胞分布均匀可以算固定面积荧光强度。成像时中心和四周有差异时，一般将四周剪切掉也可以。如果细胞分布不匀，需要找到细胞分布匀称的视野，一个视野一个视野找。
如果要用图片做结果，就要平行做多个图片，作分析，统计，每张都要求荧光分布尽量一致。
为了去除杂光的影响，可以适当调节统计荧光的强度范围，将信号过弱的背景杂光去除掉。对照组和实验组整张图片需要做同样的处理，保证所有参数均要一致。
对于不同情况荧光强度的统计方法，根据实验需要或参考文献。可以算等面积的平均强度；也可以算阈值高于一定值的平均强度；也可以算荧光的累积而不算平均。要根据课题需要选择合适的测量统计方法。

3.荧光照片效果不好？
荧光拍照存在很多变量，每一个变量都会严重影响拍照效果。
荧光拍摄条件：拍摄环境、显微镜品牌和激发荧光决定了镜下观察的效果。同样的操作方法和切片，在不同品牌显微镜下显示出完全不同的荧光强度。
荧光衰减：荧光物质的衰减通常都是非常明显的。同样的一组切片，1小时内拍摄和8小时后拍摄，荧光效果完全不同。
最好用激光共聚焦显微镜，激光共聚焦显微镜的分辨率比普通荧光显微镜要高的多，通常同一张片子激光共聚焦的效果明显更优。

4.背景荧光比较高？
在没有细胞外酯酶和其他氧化酶的情况下，荧光随时间的逐渐增加可能是来自自发水解，导致水解的原因可能与大气氧化或光诱导氧化有关。

5.荧光强度在变化？
可以观察到荧光的逐渐增加（由于自动氧化）或减少（由于细胞中的染料损失或光漂白）。在没有任何刺激或诱导的情况下，健康的未经处理的细胞中的荧光突发可以指示细胞死亡或一些其他氧化事件的进展。
注意检测时平行操作即可。

1.Yiwei Xie et al.
Graphene quantum dots induce cascadic apoptosis via interaction with proteins associated with anti-oxidation after endocytosis by Trypanosoma brucei
Frontiers in Immunology 2022 （IF=8.786）

2.C.-C. SHI et al.
MicroRNA-323-3p inhibits oxidative stress and apoptosis after myocardial infarction by targeting TGF-β2/JNK pathway
European Review for Medical and Pharmacological Sciences 2020 （IF=3.784）