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贝博® BBoxiProbe® 活性氧检测试剂盒是一种利用新型荧光探针BBoxiProbe® O06进行细胞活性氧检测的试剂盒。本试剂盒中的BBoxiProbe® O06 ROS探针为绿色荧光的活性氧探针，具有488 nm / 520 nm的最大激发/发射波长。 贝博® BBoxiProbe® O06 ROS探针在细胞中活性氧存在的条件下，被氧化生成绿色荧光物质，绿色荧光强度与细胞内活性氧水平成正比，检测O06产物的荧光强度就可以知道细胞内活性氧的水平。 在激发波长488 nm，发射波长520 nm附近，使用荧光分光光度计、荧光酶标仪、荧光显微镜、激光共聚焦显微镜、流式细胞仪等检测O06产物的荧光强度，从而测定细胞内活性氧水平。 本试剂盒可以用于各种真核培养细胞的总活性氧的检测。 活性氧(reactive oxygen species,ROS)的产生主要是氧化磷酸化的结果，在呼吸链中，在某些位点会有“泄露”的电子直接和氧气或和其他电子受体反应，在酶或非酶作用下引发一系列反应生成不同种类的活性氧：“泄露”的电子最初和氧气反应生成超氧阴离子自由基(O2•-)(图1A)。超氧阴离子遇水生成H2O2(图1B)，同时过氧化氢也可由氧气在单胺氧化酶(monoamine oxidase,MAO)的作用下生成(图1C)，生成的过氧化氢在髓过氧化物酶(myeloperoxidase, MPO)的催化下与Cl-反应可生成ClO-(图1D)，在铁或铜离子的催化下发生Fenton反应生成OH•(图1E)，超氧阴离子遇氮氧化物反应生成ONOO-(图1F)。这些生成的高氧化活性的物质统称为活性氧。 BBoxiProbe® O系列活性氧探针具有多种颜色可以选择，可根据情况对样品进行多色标记实验。除了本试剂盒的绿色荧光探针，贝博还可以提供蓝色、红色、深红色荧光的活性氧检测试剂盒。 贝博® BBoxiProbe® 可以为您提供各种细胞样本、切片样本、组织样本的活性氧、活性氮检测试剂盒产品。 贝博® BBoxiProbe® 可以为您提供总活性氧、总活性氮和各种亚型的活性氧/活性氮的检测试剂盒产品。 贝博® BBoxiProbe® 可以为您提供各种绿色、红色、蓝色、深红色的活性氧/活性氮检测试剂盒产品。 贝博® BBcellProbe® 可以提供各种细胞分析试剂盒。包括细胞凋亡、活性、增殖、毒性、活性氧、周期、细胞代谢、氧化应激、膜流动性、膜电位、膜通透性转换孔、细胞耗氧率、胞外酸化、细胞内pH、细胞粘附、细胞自噬等数百种细胞检测试剂盒产品。
2.可以根据需要分装后冻存。
3.探针为DMSO溶液，在2-8℃时是固体状态，冬季气温较低时为凝固状态，极易粘附在管壁、吸头壁。注意需要加热融解，从冰箱取出后恢复至室温或37℃短时间水浴，变成液体状态后离心至管底部再开盖。
2.贴壁细胞
2.背景低，灵敏度高；
3.线性范围宽，使用方便。
2.离心机
3.移液器
4.冰箱
5.冰盒
2.吸头
3.一次性手套
4.黑色96孔板
3.探针标记完毕并洗净残余探针后，可以进行激发波长的扫描和发射波长的扫描，以确认探针的标记情况是否正常。
4.尽量缩短探针标记后到测定所用的时间，以减少各种可能的误差。
5.原位检测必须使用荧光检测专用的黑色透明底96孔细胞培养板。
6.以下操作步骤仅供参考，请根据实际样本情况调整或参考文献。
根据样本数量，用HBSS将BBoxiProbe® O06荧光染料1000-2000倍稀释，配制成探针染色工作液。
探针标记
原位标记：仅适用于贴壁培养细胞。
1. 培养板/培养皿准备细胞样本。
2. 待细胞生长到合适丰度，去除细胞培养基，用PBS洗细胞一次。
3. 加入适量体积37℃预热的含O06探针工作液。
4. 在37℃细胞培养箱内于生长状态下避光孵育20分钟～40分钟（具体孵育时间需根据细胞类型而定，需预实验优化）。
5. 移除染色液，用PBS（pH7.4）洗涤细胞3次。以充分去除未进入细胞内的O06探针。
6. 加入200 μL HBSS缓冲液。
7. 荧光酶标仪、荧光显微镜（含合适滤片）检测。最大激发/发射波长为488 nm / 516 nm。
收集后标记：悬浮细胞或贴壁细胞消化处理
1. 离心，吸除上清培养基。
2. 用PBS洗细胞一次。
3. 细胞收集后重悬浮于稀释好的37℃预热的O06探针工作液中，细胞浓度为1*106-2*107/毫升。
4. 于生长状态下37℃细胞培养箱内避光孵育20-30分钟（具体时间需根据细胞类型而定，需预实验优化）。每隔3-5分钟颠倒混匀一下，使探针和细胞充分接触。
5. 离心，吸除染色液，加入PBS（pH7.4）重悬细胞，洗涤3次。以充分去除未进入细胞内的O06探针。
6. 用HBSS/PBS/无血清细胞培养基重悬细胞。
7. 用荧光光度计、荧光酶标仪、流式细胞仪检测。
最大激发/发射波长为488 nm / 516 nm。
活性氧检测：
1. 对于原位标记探针的样品可以用荧光酶标仪检测，或者用激光共聚焦显微镜、荧光显微镜，直接拍照分析（需要有相关的荧光强度分析软件）。
2. 或收集细胞后标记探针然后用荧光分光光度计、荧光酶标仪或流式细胞仪检测。
3. 对于收集细胞后标记探针的样品可以用荧光分光光度计、荧光酶标仪或流式细胞仪检测，用激光共聚焦显微镜直接拍照分析也可以（需要有相关的荧光强度分析软件）。
4. 使用488 nm激发波长，520 nm发射波长，实时或逐时间点检测刺激前后荧光的强弱。
探针O06的荧光光谱和FITC非常相似，可以用FITC的参数设置检测。
5. 荧光强度强，活性氧含量高。
ROS是多种物质的统称，不像某一单一活性氧指标，无法检测其绝对的含量，只能通过设置参照样本，以参照样本的倍数来反映目标样本相对含量变化，这个“相对”是针对参照的。分析结果是定性的，也是没有单位的，因为它本质上是一个比值（目标/参照）。反映的是模型样本通过具体的干预措施（如养分缺失、缺氧、药物治疗或遗传基因操控等）如何影响其ROS的变化，测定其ROS是增加或者降低了。
2.荧光照片如何分析？
需要有相关的荧光强度分析软件。ROS表达水平直接通过荧光信号的强弱和分布范围来体现。
有的显微镜扫描下来的图像本身就可以测面积和强度，可以同时测不同颜色的荧光强度。有的显微镜不支持此功能，可以将荧光染色彩色图像转换为黑白的灰度图，然后再以灰度值作为测量指标进行分析。
要结合明场的照片具体分析。如果细胞分布均匀可以算固定面积荧光强度。成像时中心和四周有差异时，一般将四周剪切掉也可以。如果细胞分布不匀，需要找到细胞分布匀称的视野，一个视野一个视野找。
如果要用图片做结果，就要平行做多个图片，作分析，统计，每张都要求荧光分布尽量一致。
为了去除杂光的影响，可以适当调节统计荧光的强度范围，将信号过弱的背景杂光去除掉。对照组和实验组整张图片需要做同样的处理，保证所有参数均要一致。
对于不同情况荧光强度的统计方法，根据实验需要或参考文献。可以算等面积的平均强度；也可以算阈值高于一定值的平均强度；也可以算荧光的累积而不算平均。要根据课题需要选择合适的测量统计方法。
Anti-recurrence/metastasis and chemosensitization therapy with thioredoxin reductase-interfering drug delivery system
Biomaterials 2020 （IF=10.273）
2.Gang Zhong et al.
Dopamine-melanin nanoparticles scavenge reactive oxygen and nitrogen species and activate autophagy for osteoarthritis therapy
Nanoscale 2019 （IF=7.233）
3.Jing Zhao et al.
In vitro Characterization of the Rapid Cytotoxicity of Anticancer Peptide HPRP-A2 through Membrane Destruction and Intracellular Mechanism against Gastric Cancer Cell Lines
PloS one 2015 （IF=3.057）
4.Gang Wang et al.
PEG2000-DPSE-coated quercetin nanoparticles remarkably enhanced anticancer effects through induced programed cell death on C6 glioma cells
Journal of Biomedical Materials Research Part A 2013 （IF=4.396）
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