贝博® BBoxiProbe® 细菌过氧亚硝基阴离子(ONOO-)检测试剂盒是一种利用新型荧光探针BBoxiProbe® O56进行细菌中过氧亚硝基阴离子(ONOO-)检测的试剂盒。本试剂盒中的BBoxiProbe® O56过氧亚硝基阴离子(ONOO-)探针为绿色荧光的过氧亚硝基阴离子探针,具有488 / 516nm的最大激发/发射波长。 贝博® BBoxiProbe® O56过氧亚硝基阴离子(ONOO-)探针在细菌中过氧亚硝基阴离子(ONOO-)存在的条件下,被氧化生成绿色荧光物质,绿色荧光强度与细菌内过氧亚硝基阴离子(ONOO-)水平成正比,检测O56产物的荧光就可以知道细菌内过氧亚硝基阴离子(ONOO-)的水平。 在激发波长488nm,发射波长526 nm附近,使用荧光分光光度计、荧光酶标仪、荧光显微镜、激光共聚焦显微镜、流式细胞仪等可以检测荧光强度的设备,可以方便测定荧光情况,从而测定细菌胞内活性氧水平。 除了本绿色荧光检测的试剂盒以外,贝博还可以提供红色荧光的检测试剂盒(相关产品:BB-461152)以及细菌培养上清的活性氧检测试剂盒(相关产品:BB-475056)。 过氧亚硝基阴离子(ONOO-,Peroxynitrite anion)是活性氧家族的一员,活性氧(Reactive oxygen species, ROS) 包括过氧化氢(H2O2,Hydrogen peroxide)、羟基自由基(•OH,Hydroxyl radical)、单线态氧(1O2,Singlet oxygen)、一氧化氮(NO,Nitric oxide)、超氧阴离子(•O2-,Superoxide anion)、过氧化自由基(ROO• ,Peroxyl radical)、过氧羟自由基(HOO• ,hydroperoxyl)及其下游产物过氧化物过氧亚硝基阴离子(ONOO-,Peroxynitrite anion)、ClO-和羟化物等,参与细胞生长增殖、发育分化、衰老和凋亡以及许多生理和病理过程。 活性氧(reactive oxygen species,ROS)的产生主要是氧化磷酸化的结果,在呼吸链中,在某些位点会有“泄露”的电子直接和氧气或和其他电子受体反应,在酶或非酶作用下引发一系列反应生成不同种类的活性氧:“泄露”的电子最初和氧气反应生成超氧阴离子自由基(O2•-)(图1A)。超氧阴离子遇水生成H2O2(图1B),同时过氧化氢也可由氧气在单胺氧化酶(monoamine oxidase,MAO)的作用下生成(图1C),生成的过氧化氢在髓过氧化物酶(myeloperoxidase, MPO)的催化下与Cl-反应可生成ClO-(图1D),在铁或铜离子的催化下发生Fenton反应生成OH•(图1E),超氧阴离子遇氮氧化物反应生成ONOO-(图1F)。这些生成的高氧化活性的物质统称为活性氧。 BBoxiProbe® O5系列过氧亚硝基阴离子探针具有多种颜色可以选择,可根据情况对样品进行多色标记实验。除了本试剂盒的绿色荧光探针,贝博还可以提供红色荧光的过氧亚硝基阴离子检测试剂盒。
2.避免反复冻融。可以根据需要分装后冻存。
3.染色液A为DMSO溶液,冬季气温较低时为凝固状态,极易粘附在管壁、吸头壁。注意需要加热融解,变成液体状态后离心至管底部再开盖。
4.可以用手捂住使其融解或37℃短时间水浴。吸头也需要放在培养箱预热,否者容易再次凝固在吸头内壁产生损耗。
5.试剂拆封后请尽快使用完!
2.背景低,灵敏度高;
3.线性范围宽,使用方便。
2.离心机
3.移液器
4.冰箱
5.冰盒
2.吸头
3.一次性手套
4.黑色96孔板
2.荧光探针标记后,一定要洗净残余的未进入细胞内的探针,否则会导致背景较高。
3.探针标记完毕并洗净残余探针后,可以进行激发波长的扫描和发射波长的扫描,以确认探针的标记情况是否正常。
4.尽量缩短探针标记后到测定所用的时间,以减少各种可能的误差。
5.O56在光照和空气中易被氧化,注意避光密封保存。
6.对不同的细菌样本,应选择合适的孵育时间和浓度,以观察ROS的变化。应根据预实验情况调整染色浓度和时间。
1. 根据样本数量,用纯水将探针稀释液B进行10倍稀释。
2. 根据样本数量,用10倍稀释过的探针稀释液B将探针进行1000倍稀释。即配成染色工作液。
O56探针标记:
1. 准备1ml新鲜待测菌液。
2. 将待测细菌样本离心收集菌体。
3. 用PBS洗涤菌体2-3次。离心收集菌体沉淀。
4. 用500ul-1ml染色工作液重悬菌体。
5. 在37℃避光孵育30分钟。
6. 孵育结束后,离心收集菌体。
7. 用PBS清洗细胞一次。离心收集菌体。
8. 用500ul PBS重悬菌体。充分混匀。
9. 取200ul加入荧光检测用96孔板。
10. 置于荧光光度计或酶标仪中,后于激发波长为488nm、发射波长520nm检测荧光强度。
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