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过氧自由基（ROO•，Peroxyl radical）是体内的一种活性氧(Reactive oxygen species, ROS) 状态，参与细胞生长增殖、发育分化、衰老和凋亡以及许多生理和病理过程。
贝博® BBoxiProbe® 过氧自由基检测试剂盒是一种利用新型荧光探针BBoxiProbe® O98进行细胞过氧自由基检测的试剂盒。本试剂盒中的BBoxiProbe® O98 过氧自由基探针为红色荧光的过氧自由基探针，具有510 nm / 610 nm的最大激发/发射波长。
贝博® BBoxiProbe® O98 ROO•探针在细胞中过氧自由基存在的条件下，被氧化生成红色荧光物质，红色荧光强度与细胞内过氧自由基水平成正比，检测O98产物的荧光强度就可以知道细胞内过氧自由基的水平。
在激发波长510 nm，发射波长610 nm附近，使用荧光分光光度计、荧光酶标仪、荧光显微镜、激光共聚焦显微镜、流式细胞仪等检测O98产物的荧光强度，从而测定细胞内过氧自由基水平。
本试剂盒可以用于各种真核培养细胞的过氧自由基的检测。
BBoxiProbe® O系列过氧自由基探针具有多种颜色可以选择，可根据情况对样品进行多色标记实验。除了本试剂盒的红色荧光探针，贝博还可以提供蓝色、绿色、深红色荧光的过氧自由基检测试剂盒。
贝博® BBoxiProbe® 可以为您提供各种细胞样本、切片样本、组织样本的活性氧、活性氮检测试剂盒产品。
贝博® BBoxiProbe® 可以为您提供总活性氧、总活性氮和各种亚型的活性氧/活性氮的检测试剂盒产品。
贝博® BBoxiProbe® 可以为您提供各种绿色、红色、蓝色、深红色的活性氧/活性氮检测试剂盒产品。
贝博® BBcellProbe® 可以提供各种细胞分析试剂盒。包括细胞凋亡、活性、增殖、毒性、活性氧、周期、细胞代谢、氧化应激、膜流动性、膜电位、膜通透性转换孔、细胞耗氧率、胞外酸化、细胞内pH、细胞粘附、细胞自噬等数百种细胞检测试剂盒产品。
贝博® BBcellProbe® 可以为您提供各种细胞成像、细胞示踪与追踪试剂盒产品。包括各种颜色的BBcellProbe® M系列、N系列、L系列、E系列、G系列等细胞膜、细胞质、细胞核、溶酶体、线粒体、内质网、高尔基体、骨架、微管等细胞、细胞亚结构荧光染色试剂盒产品，以及钙离子、钠离子、氩离子等各种荧光染色试剂盒产品。
贝博® BBcellProbe® 可以提供动物、植物、微生物、酵母、水产、家禽、兽类、土壤等样本的各种生化指标检测的数百种试剂盒产品。
贝博® BBcellProbe® 可以提供各种细胞、组织染色，免疫组织化学，细胞培养等相关试剂盒产品。
3.可以根据需要分装后冻存。
4.探针液A为DMSO溶液，冬季气温较低时为凝固状态，极易粘附在管壁、吸头壁。注意需要加热融5.可以用手捂住使其融解或37℃短时间水浴。吸头也需要放在培养箱预热，否者容易再次凝固在吸头内壁产生损耗。
6.试剂拆封后请尽快使用完！
2.荧光酶标仪
3.流式细胞仪
4.荧光显微镜
5.激光共聚焦
2.背景低，灵敏度高；
3.线性范围宽，使用方便。
2.荧光酶标仪
3.流式细胞仪
4.荧光显微镜
5.激光共聚焦
2.离心机
3.移液器
4.冰箱
5.冰盒
2.吸头
3.玻片
4.一次性手套
2.BBoxiProbe® O98荧光探针在2-8℃时是固体状态，从冰箱取出后恢复至室温，变成液体状态后离心至管底部再开盖。
3.本荧光探针在冬季气温较低时在室内时为凝固状态，极易粘附在管壁、吸头壁。注意需要加热溶解，吸头也需要放在培养箱预热，否者容易再次凝固在吸头内壁产生损耗。
4.使用前，先将本品取出回温至室温（20℃以上），并对其进行简短离心使溶液集中于管底。
5.荧光探针标记后，一定要洗净残余的未进入细胞内的探针，否则会导致背景较高。
6.探针标记完毕并洗净残余探针后，可以进行激发波长的扫描和发射波长的扫描，以确认探针的标记情况是否正常。
7.尽量缩短探针标记后到测定所用的时间，以减少各种可能的误差。
8.探针标记的时间也可以根据情况在15-60分钟内适当进行调整。
9.标记的条件因细胞种类而异，根据不同样本的实际染色结果做相应调整，在每次实验前，请先根据不同的实验要求、细胞类型、细胞的膜通透性等进行优化，确定最佳条件。以下染色操作条件仅供参考。请根据实际样本情况调整或参考文献。
10.酚红对O98荧光探针的检测有轻微干扰，需尽可能避免。
11.以下步骤仅做为参考，稀释比例和孵育时间可根据实际情况来调整。比如，对于某些细胞，如果发现未被刺激的阴性对照细胞荧光也比较强，可降低探针浓度。如果发现用感兴趣的药物刺激后荧光较弱，可升高O98探针浓度，以提高检测的灵敏度。另外，探针装载的时间也可以根据情况在15-60分钟内适当进行调整，孵育温度在4℃-37℃内调整。
12.必须使用荧光检测专用的黑色96孔板。
根据样本数量，用HBSS将BBoxiProbe® O98荧光染料1000-2000倍稀释，配制成探针染色工作液。
探针标记
原位标记：仅适用于贴壁培养细胞。
1. 培养板/培养皿准备细胞样本。
2. 待细胞生长到合适丰度，去除细胞培养基，用PBS洗细胞一次。
3. 加入适量体积37℃预热的含O98探针工作液。
4. 在37℃细胞培养箱内于生长状态下避光孵育20分钟～60分钟（具体孵育时间需根据细胞类型而定，需预实验优化）。
5. 移除染色液，用PBS（pH7.4）洗涤细胞3次。以充分去除未进入细胞内的O98探针。
6. 加入200 μL HBSS缓冲液。
7. 荧光酶标仪、荧光显微镜（含合适滤片）检测。最大激发/发射波长为510 nm / 610 nm。
收集后标记：悬浮细胞或贴壁细胞消化处理
1. 离心，吸除上清培养基。
2. 用PBS洗细胞一次。
3. 细胞收集后重悬浮于稀释好的37℃预热的O98探针工作液中，细胞浓度为1*106-2*107/毫升。
4. 于生长状态下37℃细胞培养箱内避光孵育20-45分钟（具体时间需根据细胞类型而定，需预实验优化）。每隔3-5分钟颠倒混匀一下，使探针和细胞充分接触。
5. 离心，吸除染色液，加入PBS（pH7.4）重悬细胞，洗涤3次。以充分去除未进入细胞内的O98探针。
6. 用HBSS/PBS/无血清细胞培养基重悬细胞。
7. 用荧光光度计、荧光酶标仪、流式细胞仪检测。
最大激发/发射波长为510 nm / 610 nm。
过氧自由基检测：
1. 对于原位标记探针的样品可以用荧光酶标仪检测，或者用激光共聚焦显微镜、荧光显微镜，直接拍照分析（需要有相关的荧光强度分析软件）。
2. 或收集细胞后标记探针然后用荧光分光光度计、荧光酶标仪或流式细胞仪检测。
3. 对于收集细胞后标记探针的样品可以用荧光分光光度计、荧光酶标仪或流式细胞仪检测，用激光共聚焦显微镜直接拍照分析也可以（需要有相关的荧光强度分析软件）。
4. 使用510 nm激发波长，610 nm发射波长，实时或逐时间点检测刺激前后荧光的强弱。
5. 荧光强度强，过氧自由基含量高。
【注】:
如果用显微镜拍照分析的话，需要细胞分布均匀。
本试剂为定性检测试剂盒，无法检测其绝对的含量，只能通过设置参照样本，以参照样本的倍数来反映目标样本相对含量变化，这个“相对”是针对参照的。分析结果是定性的，也是没有单位的，因为它本质上是一个比值（目标/参照）。反映的是模型样本通过具体的干预措施（如养分缺失、缺氧、药物治疗或遗传基因操控等）如何影响其ROO•的变化，测定其ROO•是增加或者降低了。
2.荧光照片如何分析？
需要有相关的荧光强度分析软件。ROO•表达水平直接通过荧光信号的强弱和分布范围来体现。
有的显微镜扫描下来的图像本身就可以测面积和强度，可以同时测不同颜色的荧光强度。有的显微镜不支持此功能，可以将荧光染色彩色图像转换为黑白的灰度图，然后再以灰度值作为测量指标进行分析。
要结合明场的照片具体分析。如果细胞分布均匀可以算固定面积荧光强度。成像时中心和四周有差异时，一般将四周剪切掉也可以。如果细胞分布不匀，需要找到细胞分布匀称的视野，一个视野一个视野找。
如果要用图片做结果，就要平行做多个图片，作分析，统计，每张都要求荧光分布尽量一致。
为了去除杂光的影响，可以适当调节统计荧光的强度范围，将信号过弱的背景杂光去除掉。对照组和实验组整张图片需要做同样的处理，保证所有参数均要一致。
对于不同情况荧光强度的统计方法，根据实验需要或参考文献。可以算等面积的平均强度；也可以算阈值高于一定值的平均强度；也可以算荧光的累积而不算平均。要根据课题需要选择合适的测量统计方法。
3.荧光照片效果不好？
荧光拍照存在很多变量，每一个变量都会严重影响拍照效果。
荧光拍摄条件：拍摄环境、显微镜品牌和激发荧光决定了镜下观察的效果。同样的操作方法和切片，在不同品牌显微镜下显示出完全不同的荧光强度。
荧光衰减：荧光物质的衰减通常都是非常明显的。同样的一组切片，1小时内拍摄和8小时后拍摄，荧光效果完全不同。
最好用激光共聚焦显微镜，激光共聚焦显微镜的分辨率比普通荧光显微镜要高的多，通常同一张片子激光共聚焦的效果明显更优。
4.背景荧光比较高？
在没有细胞外酯酶和其他氧化酶的情况下，荧光随时间的逐渐增加可能是来自自发水解，导致水解的原因可能与大气氧化或光诱导氧化有关。
5.荧光强度在变化？
可以观察到荧光的逐渐增加（由于自动氧化）或减少（由于细胞中的染料损失或光漂白）。在没有任何刺激或诱导的情况下，健康的未经处理的细胞中的荧光突发可以指示细胞死亡或一些其他氧化事件的进展。
注意检测时平行操作即可。
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