贝博® BBoxiProbe® 过氧亚硝基阴离子(ONOO-)检测试剂盒是一种利用荧光探针BBoxiProbe® O56进行过氧亚硝基阴离子检测的试剂盒。O56可以自由穿过细胞膜,进入细胞内后,在过氧亚硝基阴离子存在的条件下,O56探针被氧化生成荧光物质O56F,O56F的绿色荧光强度与细胞内过氧亚硝基阴离子水平成正比,检测O56F绿色荧光强度就可以知道细胞内过氧亚硝基阴离子的水平。 在激发波长488 nm,发射波长530 nm附近,使用荧光显微镜、激光共聚焦显微镜、荧光分光光度计、荧光酶标仪、流式细胞仪等检测O56F 荧光,从而测定细胞内过氧亚硝基阴离子水平。 贝博® BBoxiProbe® O56荧光探针对过氧亚硝基阴离子(ONOO-)有较高的选择性,但是也会与活性羟基有反应。 过氧亚硝基阴离子(ONOO-,Peroxynitrite anion)是活性氧家族的一员,活性氧(Reactive oxygen species, ROS) 包括过氧化氢(H2O2,Hydrogen peroxide)、羟基自由基(•OH,Hydroxyl radical)、单线态氧(1O2,Singlet oxygen)、一氧化氮(NO,Nitric oxide)、超氧阴离子(•O2-,Superoxide anion)、过氧化自由基(ROO• ,Peroxyl radical)、过氧羟自由基(HOO• ,hydroperoxyl)及其下游产物过氧化物过氧亚硝基阴离子(ONOO-,Peroxynitrite anion)、ClO-和羟化物等,参与细胞生长增殖、发育分化、衰老和凋亡以及许多生理和病理过程。 活性氧(reactive oxygen species,ROS)的产生主要是氧化磷酸化的结果,在呼吸链中,在某些位点会有“泄露”的电子直接和氧气或和其他电子受体反应,在酶或非酶作用下引发一系列反应生成不同种类的活性氧:“泄露”的电子最初和氧气反应生成超氧阴离子自由基(O2•-)(图1A)。超氧阴离子遇水生成H2O2(图1B),同时过氧化氢也可由氧气在单胺氧化酶(monoamine oxidase,MAO)的作用下生成(图1C),生成的过氧化氢在髓过氧化物酶(myeloperoxidase, MPO)的催化下与Cl-反应可生成ClO-(图1D),在铁或铜离子的催化下发生Fenton反应生成OH•(图1E),超氧阴离子遇氮氧化物反应生成ONOO-(图1F)。这些生成的高氧化活性的物质统称为活性氧。 本试剂盒可以用于各种真核培养细胞的检测。 BBoxiProbe® O系列活性氧探针具有多种颜色可以选择,可根据情况对样品进行多色标记实验。除了本试剂盒的绿色荧光探针,贝博还可以提供蓝色、红色、深红色荧光的活性氧检测试剂盒。 贝博® BBoxiProbe® 可以为您提供各种细胞样本、切片样本、组织样本的活性氧、活性氮检测试剂盒产品。 贝博® BBoxiProbe® 可以为您提供总活性氧、总活性氮和各种亚型的活性氧/活性氮的检测试剂盒产品。
2.可以根据需要分装后冻存。
3.探针为DMSO溶液,在2-8℃时是固体状态,冬季气温较低时为凝固状态,极易粘附在管壁、吸头壁。注意需要加热融解,从冰箱取出后恢复至室温或37℃短时间水浴,变成液体状态后离心至管底部再开盖。
2.贴壁细胞
2.背景低,灵敏度高;
3.线性范围宽,使用方便。
2.离心机
3.移液器
4.冰箱
5.冰盒
2.吸头
3.一次性手套
4.黑色96孔板
3.探针标记完毕并洗净残余探针后,可以进行激发波长的扫描和发射波长的扫描,以确认探针的标记情况是否正常。
4.尽量缩短探针标记后到测定所用的时间,以减少各种可能的误差。
5.原位检测必须使用荧光检测专用的黑色透明底96孔细胞培养板。
6.以下操作步骤仅供参考,请根据实际样本情况调整或参考文献。
1. 探针染色工作液配制:
根据样本数量,用HBSS将BBoxiProbe® O56荧光染料1000-5000倍稀释,配制成染色工作液。
2. 细胞探针标记
2.1 对于贴壁细胞,可以进行原位标记
1)培养皿/培养板准备细胞样本。
2)待细胞生长到合适丰度,吸除培养液,加入适量37℃预热的含探针工作液。于生长状态下孵育10分钟~90分钟(具体孵育时间需根据细胞类型而定,需预实验优化)。
3)移除染色液,用PBS(pH7.4)洗涤细胞3次。
4)荧光显微镜(含合适滤片)或流式细胞仪、荧光酶标仪下观察。最大激发/发射波长为488 / 530 nm。
2.2 对于悬浮细胞
1)离心,吸除上清。
2)利用37℃预热的探针工作液100-200 μl重悬细胞,于生长状态下孵育20分钟~60分钟(具体时间需根据细胞类型而定,需预实验优化)。
3)离心,吸除染色液,加入PBS(pH7.4)重悬细胞,洗涤3次。
4)流式细胞仪、荧光酶标仪检测。最大激发/发射波长为488 / 530 nm。
3.检测:
对于原位标记探针的样品可以用荧光酶标仪检测,荧光显微镜,激光共聚焦显微镜直接拍照分析,或收集细胞后用荧光分光光度计、荧光酶标仪或流式细胞仪检测。对于收集细胞后标记探针的样品可以用荧光分光光度计、荧光酶标仪或流式细胞仪检测,或者用激光共聚焦显微镜直接拍照分析亦可。
使用488 nm激发波长,530 nm发射波长,实时或逐时间点检测刺激前后荧光的强弱。
过氧亚硝基阴离子浓度高则荧光强度强。
需要有相关的荧光强度分析软件。ONOO-表达水平直接通过荧光信号的强弱和分布范围来体现。
有的显微镜扫描下来的图像本身就可以测面积和强度,可以同时测不同颜色的荧光强度。有的显微镜不支持此功能,可以将荧光染色彩色图像转换为黑白的灰度图,然后再以灰度值作为测量指标进行分析。
要结合明场的照片具体分析。如果细胞分布均匀可以算固定面积荧光强度。成像时中心和四周有差异时,一般将四周剪切掉也可以。如果细胞分布不匀,需要找到细胞分布匀称的视野,一个视野一个视野找。
如果要用图片做结果,就要平行做多个图片,作分析,统计,每张都要求荧光分布尽量一致。
为了去除杂光的影响,可以适当调节统计荧光的强度范围,将信号过弱的背景杂光去除掉。对照组和实验组整张图片需要做同样的处理,保证所有参数均要一致。
对于不同情况荧光强度的统计方法,根据实验需要或参考文献。可以算等面积的平均强度;也可以算阈值高于一定值的平均强度;也可以算荧光的累积而不算平均。要根据课题需要选择合适的测量统计方法。
Biomimetic Metal–Organic Framework Composite-Mediated Cascade Catalysis for Synergistic Bacteria Killing
ACS Applied Materials & Interfaces 2020 (IF=8.758)
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