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贝博® BBoxiProbe® 羟基自由基（•OH）检测试剂盒是一种利用羟基自由基（•OH）特异性绿色荧光探针BBoxiProbe® O26进行羟基自由基检测的试剂盒。
BBoxiProbe® O26可自由透过活细胞膜进入细胞内，并被细胞内的羟基自由基（•OH）氧化，产生绿色荧光产物。根据活细胞中绿色荧光的产生，可以判断细胞羟基自由基（•OH）含量的多少和变化。用流式细胞仪或荧光显微镜可直接分析，是一种快速简便的组织或培养活细胞中羟基自由基（•OH）检测方法。
在激发波长488 nm，发射波长525 nm附近，使用荧光显微镜、激光共聚焦显微镜、荧光分光光度计、荧光酶标仪、流式细胞仪等检测荧光强度，从而测定细胞内羟基自由基（•OH）水平。
本试剂盒可以用于各种真核培养细胞的羟基自由基的快速定性检测。通过荧光强度的大小来快速确定具体的干预措施（如养分缺失、缺氧、药物治疗或遗传基因操控等）如何影响细胞的羟自由基变化，羟自由基增加的样本荧光强度大。
除了本绿色荧光检测试剂盒外，贝博® 还可以提供红色荧光的羟基自由基（•OH）检测试剂（相关产品：BB-4705622）。
活性氧(Reactive oxygen species, ROS) 包括过氧化氢（H2O2，Hydrogen peroxide）、羟基自由基（•OH，Hydroxyl radical）、单线态氧（1O2，Singlet oxygen）、一氧化氮（NO，Nitric oxide）、超氧阴离子(•O2-，Superoxide anion)、过氧化自由基(ROO• ，Peroxyl radical)、过氧羟自由基（HOO• ，hydroperoxyl）及其下游产物过氧化物过氧亚硝基阴离子（ONOO-，Peroxynitrite anion）、ClO-和羟化物等，参与细胞生长增殖、发育分化、衰老和凋亡以及许多生理和病理过程。
贝博® BBoxiProbe® 可以为您提供各种细胞样本、切片样本、组织样本的活性氧、活性氮检测试剂盒产品。
贝博® BBoxiProbe® 可以为您提供总活性氧、总活性氮和各种亚型的活性氧/活性氮的检测试剂盒产品。
贝博® BBoxiProbe® 可以为您提供各种绿色、红色、蓝色、深红色的活性氧/活性氮检测试剂盒产品。
贝博® BBcellProbe® 可以提供各种细胞分析试剂盒。包括细胞凋亡、活性、增殖、毒性、活性氧、周期、细胞代谢、氧化应激、膜流动性、膜电位、膜通透性转换孔、细胞耗氧率、胞外酸化、细胞内pH、细胞粘附、细胞自噬等数百种细胞检测试剂盒产品。
2.探针液A为DMSO溶液，冬季气温较低时为凝固状态，极易粘附在管壁、吸头壁。注意需要加热融解，变成液体状态后离心至管底部再开盖。
3.可以用手捂住使其融解或37℃短时间水浴。吸头也需要放在培养箱预热，否者容易再次凝固在吸头内壁产生损耗。
4.试剂拆封后请尽快使用完！
2.荧光酶标仪
3.流式细胞仪
4.荧光显微镜
5.激光共聚焦
2.背景低，灵敏度高；
3.线性范围宽，使用方便。
2.荧光酶标仪
3.流式细胞仪
4.荧光显微镜
5.激光共聚焦
2.离心机
3.移液器
4.冰箱
5.冰盒
2.吸头
3.一次性手套
4.黑色96孔板
2.荧光探针标记后，一定要洗净残余的未进入细胞内的探针，否则会导致背景较高。
3.探针标记完毕并洗净残余探针后，可以进行激发波长的扫描和发射波长的扫描，以确认探针的标记情况是否正常。
4.尽量缩短探针标记后到测定所用的时间，以减少各种可能的误差。
5.BBoxiProbe® O26探针在光照和空气中易被氧化，注意避光密封保存。
6.对不同的细胞，应选择合适的孵育时间，以观察羟自由基的变化。
7.由于染色工作液稳定性比较差，染色工作液必须现配现用，并且在当天用完。
8.探针对湿度非常敏感，若是探针溶液每次取完需要量后，必须紧紧密封盖子。建议根据单次用量，分装密封保存。不可使用含水的吸头。
9.试剂A母液请拧紧螺旋盖，避免受潮失效。
10.必须使用荧光检测专用的黑色96孔板。
1. BBoxiProbe® O26溶液可在新鲜无血清培养基、HBSS缓冲液、PBS缓冲盐溶液稀释到所需浓度，1000倍稀释，以此染色工作液更换细胞培养基；也可直接向细胞孵育液体中加入BBoxiProbe® O26探针溶液至所需浓度。
2. 依据细胞羟自由基含量的不同，孵育时间可选择15-60 分钟，在37℃或室温进行避光孵育。
3. 孵育结束后，用新鲜溶液清洗细胞。
4. 用相关仪器进行荧光检测。
【注】:
荧光强，羟自由基强度高。
对于原位标记探针的样品可以用激光共聚焦显微镜直接拍照分析，或收集细胞后用荧光分光光度计、荧光酶标仪或流式细胞仪检测。
对于收集细胞后标记探针的样品可以用荧光分光光度计、荧光酶标仪或流式细胞仪检测，用激光共聚焦显微镜直接拍照分析也可以。
使用488 nm激发波长，525 nm发射波长，实时或逐时间点检测刺激前后荧光的强弱变化。
荧光显微镜检测：
1. 对贴壁生长细胞或活组织，可直接在荧光显微镜下染色拍照分析；
2. 对悬浮生长细胞，染色后取25-50μl细胞悬液滴到一张显微载玻片上，再盖上一张盖玻片。
3. 荧光显微镜分析。
流式细胞仪分析：
1. 对贴壁生长细胞，用胰酶消化制备成单细胞悬液；对悬浮生长细胞，直接收集细胞。用0.5~1 ml冰冷PBS重悬细胞（5~10万）。
2. 采用488 nm波长激发，测定525 nm的发射，羟自由基强度高的细胞有较强的绿色荧光。
通过设置参照样本，以参照样本的倍数来反映目标样本相对含量变化，这个“相对”是针对参照的。分析结果是定性的，也是没有单位的，因为它本质上是一个比值（目标/参照）。反映的是模型样本通过具体的干预措施（如养分缺失、缺氧、药物治疗或遗传基因操控等）如何影响其羟自由基的变化，测定其羟自由基是增加或者降低了。
2.荧光照片如何分析？
需要有相关的荧光强度分析软件。羟自由基表达水平直接通过荧光信号的强弱和分布范围来体现。
有的显微镜扫描下来的图像本身就可以测面积和强度，可以同时测不同颜色的荧光强度。有的显微镜不支持此功能，可以将荧光染色彩色图像转换为黑白的灰度图，然后再以灰度值作为测量指标进行分析。
要结合明场的照片具体分析。如果细胞分布均匀可以算固定面积荧光强度。成像时中心和四周有差异时，一般将四周剪切掉也可以。如果细胞分布不匀，需要找到细胞分布匀称的视野，一个视野一个视野找。
如果要用图片做结果，就要平行做多个图片，作分析，统计，每张都要求荧光分布尽量一致。
为了去除杂光的影响，可以适当调节统计荧光的强度范围，将信号过弱的背景杂光去除掉。对照组和实验组整张图片需要做同样的处理，保证所有参数均要一致。
对于不同情况荧光强度的统计方法，根据实验需要或参考文献。可以算等面积的平均强度；也可以算阈值高于一定值的平均强度；也可以算荧光的累积而不算平均。要根据课题需要选择合适的测量统计方法。
3.荧光照片效果不好？
荧光拍照存在很多变量，每一个变量都会严重影响拍照效果。
荧光拍摄条件：拍摄环境、显微镜品牌和激发荧光决定了镜下观察的效果。同样的操作方法和切片，在不同品牌显微镜下显示出完全不同的荧光强度。
荧光衰减：荧光物质的衰减通常都是非常明显的。同样的一组切片，1小时内拍摄和8小时后拍摄，荧光效果完全不同。
最好用激光共聚焦显微镜，激光共聚焦显微镜的分辨率比普通荧光显微镜要高的多，通常同一张片子激光共聚焦的效果明显更优。
4.背景荧光比较高？
在没有细胞外酯酶和其他氧化酶的情况下，荧光随时间的逐渐增加可能是来自自发水解，导致水解的原因可能与大气氧化或光诱导氧化有关。
5.荧光强度在变化？
可以观察到荧光的逐渐增加（由于自动氧化）或减少（由于细胞中的染料损失或光漂白）。在没有任何刺激或诱导的情况下，健康的未经处理的细胞中的荧光突发可以指示细胞死亡或一些其他氧化事件的进展。
注意检测时平行操作即可。
Tumor cell-activated “Sustainable ROS Generator” with homogeneous intratumoral distribution property for improved anti-tumor therapy
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