过氧化氢(H2O2,Hydrogen peroxide)是体内的一种活性氧(Reactive oxygen species, ROS) 状态,参与细胞生长增殖、发育分化、衰老和凋亡以及许多生理和病理过程。 活性氧(Reactive oxygen species, ROS) 包括过氧化氢(H2O2,Hydrogen peroxide)、羟基自由基(•OH,Hydroxyl radical)、单线态氧(1O2,Singlet oxygen)、一氧化氮(NO,Nitric oxide)、超氧阴离子(•O2-,Superoxide anion)、过氧化自由基(ROO• ,Peroxyl radical)、过氧羟自由基(HOO• ,hydroperoxyl)及其下游产物过氧化物过氧亚硝基阴离子(ONOO-,Peroxynitrite anion)、ClO-和羟化物等,参与细胞生长增殖、发育分化、衰老和凋亡以及许多生理和病理过程。 活性氧(reactive oxygen species,ROS)的产生主要是氧化磷酸化的结果,在呼吸链中,在某些位点会有“泄露”的电子直接和氧气或和其他电子受体反应,在酶或非酶作用下引发一系列反应生成不同种类的活性氧:“泄露”的电子最初和氧气反应生成超氧阴离子自由基(O2•-)(图1A)。超氧阴离子遇水生成H2O2(图1B),同时过氧化氢也可由氧气在单胺氧化酶(monoamine oxidase,MAO)的作用下生成(图1C),生成的过氧化氢在髓过氧化物酶(myeloperoxidase, MPO)的催化下与Cl-反应可生成ClO-(图1D),在铁或铜离子的催化下发生Fenton反应生成OH•(图1E),超氧阴离子遇氮氧化物反应生成ONOO-(图1F)。这些生成的高氧化活性的物质统称为活性氧。 贝博® BBoxiProbe® 过氧化氢检测试剂盒是利用过氧化氢特异性荧光探针BBoxiProbe® 过氧化氢探针O16检测过氧化氢的试剂盒。BBoxiProbe® 过氧化氢探针O16是贝博合成的苯蒽类荧光探针,可以自由穿过细胞膜,进入细胞内后,与细胞内过氧化氢反应,被氧化生成绿色荧光物质,绿色荧光强度与细胞内过氧化氢水平成正比,检测绿色荧光就可以知道细胞内过氧化氢的变化情况。 在激发波长488 nm,发射波长526 nm附近,使用荧光显微镜、激光共聚焦显微镜、荧光分光光度计、荧光酶标仪、流式细胞仪等检测绿色 荧光,从而测定细胞内过氧化氢水平。 贝博® BBcellProbe® 可以提供各种细胞检测试剂盒。包括细胞凋亡、活性、增殖、毒性、活性氧、周期、细胞代谢、氧化应激、膜流动性、膜电位、膜通透性转换孔、细胞耗氧率、胞外酸化、细胞内pH、细胞粘附、细胞自噬等数百种细胞检测试剂盒产品。
2.探针液A为DMSO溶液,冬季气温较低时为凝固状态,极易粘附在管壁、吸头壁。注意需要加热融解,变成液体状态后离心至管底部再开盖。
3.可以用手捂住使其融解或37℃短时间水浴。吸头也需要放在培养箱预热,否者容易再次凝固在吸头内壁产生损耗。
4.试剂拆封后请尽快使用完!
2.贴壁细胞
2.背景低,灵敏度高;
3.线性范围宽,使用方便。
2.离心机
3.移液器
4.冰箱
5.冰盒
2.吸头
3.一次性手套
4.黑色96孔板
2.荧光探针标记后,一定要洗净残余的未进入细胞内的探针,否则会导致背景较高。
3.探针标记完毕并洗净残余探针后,可以进行激发波长的扫描和发射波长的扫描,以确认探针的标记情况是否正常。
4.尽量缩短探针标记后到测定所用的时间,以减少各种可能的误差。
5.过氧化氢O16探针在光照和空气中易被氧化,注意避光密封保存。
6.O16染色工作液必须现配现用,并且在当天用完。
7.BBoxiProbe® O16对湿度非常敏感,若是O16溶液每次取完需要量后,必须紧紧密封盖子。建议根据单次用量,分装密封保存。不可使用含水的吸头。
8.对不同的细胞,应选择合适的孵育时间和浓度,以观察过氧化氢的变化,很多细胞内的过氧化氢绝对水平较低,需要根据实际情况适当延长孵育时间。
9.过氧化氢O16探针可以根据需要的用量分装后冻存,避免反复冻融。
10.过氧化氢O16不可以一次性全部稀释后长期保存不用,稀释后稳定性变差,有效期缩短。
根据样本数量计算需要的用量,用试剂B探针稀释液5倍稀释过氧化氢O16探针后充分混匀,避光保存备用。
以下再用无血清培养基或HBSS缓冲盐溶液稀释100-200倍至染色所需的工作液浓度(500-1000倍稀释)。
过氧化氢O16探针标记:
1. 过氧化氢O16溶液可在新鲜无血清培养基、HBSS缓冲盐溶液稀释到所需浓度,终浓度按试剂盒的母液的200-1000倍稀释,以此染色液更换细胞培养液;也可直接向无血清细胞孵育液体中加入过氧化氢O16探针溶液至所需浓度。
2. 依据细胞过氧化氢含量的不同,过氧化氢O16探针终浓度可选择在200-1000倍稀释的范围,一般500倍稀释即可。孵育时间可选择20分钟-4小时,在37℃或室温进行避光孵育。
3. 孵育结束后,用PBS等新鲜溶液清洗细胞。漂洗时间要短。
原位标记:仅适用于贴壁培养细胞。
1. 按照1:500-1000用无血清培养基稀释BBoxiProbe® O16探针。
2. 去除细胞培养基,用PBS洗细胞一次。
3. 加入适当体积稀释好的BBoxiProbe® O16探针。加入的体积以能充分盖住细胞为宜,通常对于六孔板的一个孔加入稀释好的BBoxiProbe® O16探针不少于1毫升。
4. 在37℃细胞培养箱内避光孵育20-60分钟。
5. 用无血清细胞培养液洗涤细胞三次,以充分去除未进入细胞内的BBoxiProbe® O16探针。
收集后标记:悬浮细胞或贴壁细胞消化处理
1. 按照1:500-1000用无血清培养基稀释BBoxiProbe® O16探针。
2. 离心移除培养基,用PBS洗细胞一次。
3. 细胞收集后悬浮于稀释好的BBoxiProbe® O16探针中,细胞浓度为1*106-2*107/毫升,37℃细胞培养箱内避光孵育20-60分钟。每隔3-5分钟颠倒混匀一下,使探针和细胞充分接触。
4. 用无血清细胞培养基洗涤细胞三次,以充分去除未进入细胞内的BBoxiProbe® O16探针。
5. 用无血清细胞培养基重悬细胞。
荧光显微镜观察:
1. 对贴壁生长细胞或活组织,可直接在荧光显微镜下观察;对悬浮生长细胞,取25-50 μl细胞悬液滴到一张显微载玻片上,再盖上一张盖玻片。
2. 荧光显微镜下观察。
流式细胞仪分析:
1. 对贴壁生长细胞,用胰酶消化制备成单细胞悬液;对悬浮生长细胞,直接收集细胞。用0.5~1 ml冰冷PBS重悬细胞(5~10万)。
2. 采用488 nm波长激发,测定待测细胞平均荧光强度。使用488 nm激发波长,525 nm发射波长,实时或逐时间点检测刺激前后荧光的强弱。探针O16的荧光光谱和FITC非常相似,可以用FITC的参数设置检测探针O16产物。
Hydrogen Peroxide-Activatable Nanoparticles for Luminescence Imaging and In Situ Triggerable Photodynamic Therapy of Cancer
ACS Applied Materials & Interfaces 2020
2.Yun Zhang et al.
TGF-β3 Induces Autophagic Activity by Increasing ROS Generation in a NOX4-Dependent Pathway
Mediators of Inflammation 2019
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