-20℃ 避光保存。

1.染料长期不用可以-20℃保存。避免反复冻融。
2.染色液A为DMSO溶液，冬季气温较低时为凝固状态，极易粘附在管壁、吸头壁。注意需要加热融解，变成液体状态后离心至管底部再开盖。
3.可以用手捂住使其融解或37℃短时间水浴。吸头也需要放在培养箱预热，否者容易再次凝固在吸头内壁产生损耗。
4.试剂拆封后请尽快使用完！

6个月

1.激光共聚焦显微镜
2.荧光显微镜

1.新鲜冰冻切片
2.振动切片
3.石蜡切片

1.使用方便：可用荧光显微镜直接拍照分析；
2.背景低，灵敏度高；
3.线性范围宽，使用方便。

1.激光共聚焦显微镜
2.荧光显微镜

1.激光共聚焦显微镜/荧光显微镜
2.移液器
3.冰箱
4.冰盒

PBS 缓冲液或者HBSS

1.离心管
2.吸头
3.玻片
4.一次性手套

1.螺旋盖微量试剂管装的试剂在开盖前请短暂离心，将盖内壁上的液体收集至管底，避免开盖时液体洒落。
2.尽量缩短探针标记后到测定所用的时间，以减少各种可能的误差。
3.对于某些样本，如果荧光太强，可以按照1:200-1:2000稀释探针。探针标记的时间也可以根据情况在20-60分钟内适当进行调整。
4.冰冻切片制作不需要经过固定脱水包埋等步骤，直接冷冻后切片贴片。
5.有条件也可以采用振动切片的方法。有些方便处理的样品类型也可以采用徒手切片。
6.以下操作步骤仅供参考，请根据实际样本情况调整。

一、 试剂配制
1. 根据样本数，用纯水将BBoxiProbe® O08活性氧荧光探针200-2000倍稀释，配成染色工作液。
2. 用纯水将10X清洗液10倍稀释，配成1X清洗液工作液。

二、 探针标记
1. 准备待测的厚为10-20 μm的未经固定处理的冰冻切片。
2. 室温下，小心加上200 μl清洗液工作液，铺满整个切片表面，静置3-5分钟。
3. 小心吸除清洗液。
4. 滴加100-200 μl染色工作液，在37℃培养箱避光孵育20-60分钟。
5. 移除染色液。
6. 用PBS洗涤切片2-3次。
7. 加盖玻片或甘油封片。
8. 荧光显微镜检测。
【注】:
 染色完成后，立即进行荧光定性分析。
 激发波长535 nm，发射波长610 nm。
 荧光强，表明活性氧（ROS）含量高。
 拍照后，用相应的图像分析软件进行光密度分析。可以用实验中对照样本的荧光强度值为基准，待测组样本的荧光强度值占对照样本的百分比来比较活性氧（ROS）程度差异。

1.活性氧结果如何分析？
ROS是多种物质的统称，不像某一单一活性氧指标，无法检测其绝对的含量，只能通过设置参照样本，以参照样本的倍数来反映目标样本相对含量变化，这个“相对”是针对参照的。分析结果是定性的，也是没有单位的，因为它本质上是一个比值（目标/参照）。反映的是模型样本通过具体的干预措施（如养分缺失、缺氧、药物治疗或遗传基因操控等）如何影响其ROS的变化，测定其ROS是增加或者降低了。

2.荧光照片如何分析？
需要有相关的荧光强度分析软件。ROS表达水平直接通过荧光信号的强弱和分布范围来体现。
有的显微镜扫描下来的图像本身就可以测面积和强度，可以同时测不同颜色的荧光强度。有的显微镜不支持此功能，可以将荧光染色彩色图像转换为黑白的灰度图，然后再以灰度值作为测量指标进行分析。
要结合明场的照片具体分析。如果细胞分布均匀可以算固定面积荧光强度。成像时中心和四周有差异时，一般将四周剪切掉也可以。如果细胞分布不匀，需要找到细胞分布匀称的视野，一个视野一个视野找。
如果要用图片做结果，就要平行做多个图片，作分析，统计，每张都要求荧光分布尽量一致。
为了去除杂光的影响，可以适当调节统计荧光的强度范围，将信号过弱的背景杂光去除掉。对照组和实验组整张图片需要做同样的处理，保证所有参数均要一致。
对于不同情况荧光强度的统计方法，根据实验需要或参考文献。可以算等面积的平均强度；也可以算阈值高于一定值的平均强度；也可以算荧光的累积而不算平均。要根据课题需要选择合适的测量统计方法。

3.荧光照片效果不好？
荧光拍照存在很多变量，每一个变量都会严重影响拍照效果。
荧光拍摄条件：拍摄环境、显微镜品牌和激发荧光决定了镜下观察的效果。同样的操作方法和切片，在不同品牌显微镜下显示出完全不同的荧光强度。
荧光衰减：荧光物质的衰减通常都是非常明显的。同样的一组切片，1小时内拍摄和8小时后拍摄，荧光效果完全不同。
最好用激光共聚焦显微镜，激光共聚焦显微镜的分辨率比普通荧光显微镜要高的多，通常同一张片子激光共聚焦的效果明显更优。

4.背景荧光比较高？
在没有细胞外酯酶和其他氧化酶的情况下，荧光随时间的逐渐增加可能是来自自发水解，导致水解的原因可能与大气氧化或光诱导氧化有关。

5.荧光强度在变化？
可以观察到荧光的逐渐增加（由于自动氧化）或减少（由于细胞中的染料损失或光漂白）。在没有任何刺激或诱导的情况下，健康的未经处理的细胞中的荧光突发可以指示细胞死亡或一些其他氧化事件的进展。
注意检测时平行操作即可。

1.Huijie An et al.
Hydrogen Peroxide-Activatable Nanoparticles for Luminescence Imaging and In Situ Triggerable Photodynamic Therapy of Cancer
ACS Applied Materials & Interfaces 2020 （IF=9.229）

2.JinjinJiang et al.
Combined exposure of fine particulate matter and high-fat diet aggravate the cardiac fibrosis in C57BL/6J mice
Journal of Hazardous Materials 2020 （IF=10.588）

3.Jingyu Song et al.
Protective effect of Berberine on reproductive function and spermatogenesis in diabetic rats via inhibition of ROS/JAK2/NFκB pathway
Andrology 2020 （IF=3.842）