2-8℃ 避光

1.探针长期不用可以-20℃保存。避免反复冻融。
2.探针为DMSO溶液，冬季气温较低时为凝固状态，极易粘附在管壁、吸头壁。注意需要加热融解，变成液体状态后离心至管底部再开盖。
3.可以用手捂住使其融解或37℃短时间水浴。吸头也需要放在培养箱预热，否者容易再次凝固在吸头内壁产生损耗。
4.试剂拆封后请尽快使用完！

一年。

1.荧光酶标仪
2.荧光光度计

1.新鲜组织
2.冻存组织

1.使用方便：可用荧光酶标仪、荧光分光光度计检测；
2.背景低，灵敏度高；
3.线性范围宽，使用方便。

1.荧光酶标仪
2.荧光光度计

1.荧光光度计或荧光酶标仪，
2.离心机
3.移液器
4.冰箱
5.冰盒

PBS缓冲液HBSS

1.离心管
2.吸头
3.一次性手套
4.荧光专用黑色96孔板

1.螺旋盖微量试剂管装的试剂在开盖前请短暂离心，将盖内壁上的液体收集至管底，避免开盖时液体洒落。
2.BBoxiProbe® O06探针染色液为DMSO溶液，冬季气温较低时在室温时为凝固状态，极易粘附在管壁、吸头壁。注意需要加热溶解，吸头也需要放在培养箱预热，否者容易再次凝固在吸头内壁产生损耗。
3.使用前，先将本品取出回温至室温，并对其进行简短离心使DMSO溶液集中于管底。
4.尽量缩短探针标记后到测定所用的时间，以减少各种可能的误差。
5.必须使用荧光检测专用的黑色96孔板。

试剂准备：
根据样本数量，用纯水将O06探针10倍稀释。充分混匀，备用。

样本处理：
1. 刚取得的新鲜组织样本用PBS洗净。
2. 准确称取50 mg或100 mg组织样本，加入500 μl - 1 ml检测缓冲液A，用匀浆机/匀浆器充分匀浆。

样本检测：
1. 在96孔板中加入190微升匀浆上清液、10微升O06探针，用移液器吹打，使之充分混匀。
2. 在37℃避光孵育20-30分钟。
3. 置于酶标仪中，后于激发波长为488 nm、发射波长526 nm检测荧光强度。

蛋白定量：
1. 另取50微升上清匀浆液，用PBS大约稀释20-30倍。
2. 取100微升进行蛋白定量，测定蛋白浓度（mg/ml）。

结果处理：
以荧光强度（RFU）/蛋白浓度（毫克蛋白）表示组织活性氧强度。

1.活性氧结果如何分析？
ROS是多种物质的统称，不像某一单一活性氧指标，无法检测其绝对的含量，只能通过设置参照样本，以参照样本的倍数来反映目标样本相对含量变化，这个“相对”是针对参照的。分析结果是定性的，也是没有单位的，因为它本质上是一个比值（目标/参照）。反映的是模型样本通过具体的干预措施（如养分缺失、缺氧、药物治疗或遗传基因操控等）如何影响其ROS的变化，测定其ROS是增加或者降低了。

2.背景荧光比较高？
在没有细胞外酯酶和其他氧化酶的情况下，荧光随时间的逐渐增加可能是来自自发水解，导致水解的原因可能与大气氧化或光诱导氧化有关。

3.荧光强度在变化？
可以观察到荧光的逐渐增加（由于自动氧化）或减少（由于细胞中的染料损失或光漂白）。在没有任何刺激或诱导的情况下，健康的未经处理的样本中的荧光突发可以指示细胞死亡或一些其他氧化事件的进展。
注意检测时平行操作即可。

1.Jichun Yang et al.
Anti-recurrence/metastasis and chemosensitization therapy with thioredoxin reductase-interfering drug delivery system
Biomaterials 2020 （IF=10.317）

2.Gang Zhong et al.
Dopamine-melanin nanoparticles scavenge reactive oxygen and nitrogen species and activate autophagy for osteoarthritis therapy
Nanoscale 2019 （IF=7.233）

3.Qi He et al.
Parkin-Dependent Mitophagy Is Required for the Inhibition of ATF4 on NLRP3 Inflammasome Activation in Cerebral Ischemia-Reperfusion Injury in Rats
Cells 2019 （IF=5.656）

4.Jiayi Zhang et al.
Resveratrol regulates the recovery of rat sciatic nerve crush injury by promoting the autophagy of Schwann cells
Life Sciences 2020 （IF=3.647）

5.Qi Zhang et al.
Comparative transcriptomics and transcriptional regulation analysis of enhanced laccase production induced by co-culture of Pleurotus eryngii var. ferulae with Rhodotorula mucilaginosa
Applied Microbiology and Biotechnology 2020 （IF=3.67）