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贝博® BBoxiProbe® 活性氧检测试剂盒是一种利用新型荧光探针BBoxiProbe® O06进行细胞活性氧检测的试剂盒。本试剂盒中的BBoxiProbe® O06 ROS探针为绿色荧光的活性氧探针，具有488 nm / 520 nm的最大激发/发射波长。 贝博® BBoxiProbe® O06 ROS探针在细胞中活性氧存在的条件下，被氧化生成绿色荧光物质，绿色荧光强度与细胞内活性氧水平成正比，检测O06产物的荧光强度就可以知道细胞内活性氧的水平。 在激发波长488 nm，发射波长520 nm附近，使用荧光分光光度计、荧光酶标仪、荧光显微镜、激光共聚焦显微镜、流式细胞仪等检测O06产物的荧光强度，从而测定细胞内活性氧水平。 本试剂盒可以用于各种真核培养细胞的总活性氧的检测。 活性氧(Reactive oxygen species, ROS) 包括过氧化氢（H2O2，Hydrogen peroxide）、羟基自由基（•OH，Hydroxyl radical）、单线态氧（1O2，Singlet oxygen）、一氧化氮（NO，Nitric oxide）、超氧阴离子(•O2-，Superoxide anion)、过氧化自由基(ROO• ，Peroxyl radical)、过氧羟自由基（HOO• ，hydroperoxyl）及其下游产物过氧化物过氧亚硝基阴离子（ONOO-，Peroxynitrite anion）、ClO-和羟化物等，参与细胞生长增殖、发育分化、衰老和凋亡以及许多生理和病理过程。
2.探针为DMSO溶液，冬季气温较低时为凝固状态，极易粘附在管壁、吸头壁。注意需要加热融解，变成液体状态后离心至管底部再开盖。
3.可以用手捂住使其融解或37℃短时间水浴。吸头也需要放在培养箱预热，否者容易再次凝固在吸头内壁产生损耗。
4.试剂拆封后请尽快使用完！
2.贴壁细胞
2.背景低，灵敏度高；
3.线性范围宽，使用方便。
流式细胞仪、激光共聚焦、荧光显微镜等
2.离心机
3.移液器
4.冰箱
5.冰盒
2.吸头
3.一次性手套
4.荧光检测专用黑色96孔板
2.BBoxiProbe® O06荧光探针在2-8℃时是固体状态，从冰箱取出后恢复至室温，变成液体状态后离心至管底部再开盖。
3.本荧光探针在冬季气温较低时在室内时为凝固状态，极易粘附在管壁、吸头壁。注意需要加热溶解，吸头也需要放在培养箱预热，否者容易再次凝固在吸头内壁产生损耗。
4.使用前，先将本品取出回温至室温（20℃以上），并对其进行简短离心使溶液集中于管底。
5.荧光探针标记后，一定要洗净残余的未进入细胞内的探针，否则会导致背景较高。
6.探针标记完毕并洗净残余探针后，可以进行激发波长的扫描和发射波长的扫描，以确认探针的标记情况是否正常。
7.尽量缩短探针标记后到测定所用的时间，以减少各种可能的误差。
8.探针标记的时间也可以根据情况在15-60分钟内适当进行调整。
9.标记的条件因细胞种类而异，根据不同样本的实际染色结果做相应调整，在每次实验前，请先根据不同的实验要求、细胞类型、细胞的膜通透性等进行优化，确定最佳条件。以下染色操作条件仅供参考。请根据实际样本情况调整或参考文献。
10.酚红对O06荧光探针的检测有轻微干扰，需尽可能避免。
11.以下步骤仅做为参考，稀释比例和孵育时间可根据实际情况来调整。比如，对于某些细胞，如果发现未被刺激的阴性对照细胞荧光也比较强，可降低探针浓度。如果发现用感兴趣的药物刺激后荧光较弱，可升高O06探针浓度，以提高检测的灵敏度。另外，探针装载的时间也可以根据情况在15-60分钟内适当进行调整，孵育温度在4℃-37℃内调整。
12.必须使用荧光检测专用的黑色96孔板。
原位标记：仅适用于贴壁培养细胞。
1. 按照1:1000-2000用无血清培养基稀释O06探针。
2. 去除细胞培养基，用PBS洗细胞一次。
3. 加入适当体积稀释好的O06探针。加入的体积以能充分盖住细胞为宜，通常对于六孔板的一个孔加入稀释好的O06探针不少于1毫升。
4. 在37℃细胞培养箱内避光孵育20分钟。
5. 用无血清细胞培养液洗涤细胞三次，以充分去除未进入细胞内的O06探针。
收集后标记：悬浮细胞或贴壁细胞消化处理
1. 按照1:1000用无血清培养基稀释O06探针。
2. 离心移除培养基，用PBS洗细胞一次。
3. 细胞收集后悬浮于稀释好的O06探针中，细胞浓度为1*106-2*107/毫升，37℃细胞培养箱内避光孵育20分钟。每隔3-5分钟颠倒混匀一下，使探针和细胞充分接触。
4. 用无血清细胞培养基洗涤细胞三次，以充分去除未进入细胞内的O06探针。
5. 用无血清细胞培养基重悬细胞。
二、 检测：
对于原位标记探针的样品可以用激光共聚焦显微镜直接观察，或收集细胞后用荧光分光光度计、荧光酶标仪或流式细胞仪检测。
荧光强度强，活性氧强度高。
对于收集细胞后标记探针的样品可以用荧光分光光度计、荧光酶标仪或流式细胞仪检测，用激光共聚焦显微镜直接观察也可以。
使用488 nm激发波长，525 nm发射波长，实时或逐时间点检测刺激前后荧光的强弱。O06探针的荧光光谱和FITC非常相似，可以用FITC的参数设置检测。
ROS是多种物质的统称，不像某一单一活性氧指标，无法检测其绝对的含量，只能通过设置参照样本，以参照样本的倍数来反映目标样本相对含量变化，这个“相对”是针对参照的。分析结果是定性的，也是没有单位的，因为它本质上是一个比值（目标/参照）。反映的是模型样本通过具体的干预措施（如养分缺失、缺氧、药物治疗或遗传基因操控等）如何影响其ROS的变化，测定其ROS是增加或者降低了。
2.荧光照片如何分析？
需要有相关的荧光强度分析软件。ROS表达水平直接通过荧光信号的强弱和分布范围来体现。
有的显微镜扫描下来的图像本身就可以测面积和强度，可以同时测不同颜色的荧光强度。有的显微镜不支持此功能，可以将荧光染色彩色图像转换为黑白的灰度图，然后再以灰度值作为测量指标进行分析。
要结合明场的照片具体分析。如果细胞分布均匀可以算固定面积荧光强度。成像时中心和四周有差异时，一般将四周剪切掉也可以。如果细胞分布不匀，需要找到细胞分布匀称的视野，一个视野一个视野找。
如果要用图片做结果，就要平行做多个图片，作分析，统计，每张都要求荧光分布尽量一致。
为了去除杂光的影响，可以适当调节统计荧光的强度范围，将信号过弱的背景杂光去除掉。对照组和实验组整张图片需要做同样的处理，保证所有参数均要一致。
对于不同情况荧光强度的统计方法，根据实验需要或参考文献。可以算等面积的平均强度；也可以算阈值高于一定值的平均强度；也可以算荧光的累积而不算平均。要根据课题需要选择合适的测量统计方法。
Dopamine-melanin nanoparticles scavenge reactive oxygen and nitrogen species and activate autophagy for osteoarthritis therapy
Nanoscale 2019 （IF=7.233）
2.Jing Zhao et al.
In vitro Characterization of the Rapid Cytotoxicity of Anticancer Peptide HPRP-A2 through Membrane Destruction and Intracellular Mechanism against Gastric Cancer Cell Lines
PloS one 2015 （IF=3.057）
3.Gang Wang et al.
PEG2000-DPSE-coated quercetin nanoparticles remarkably enhanced anticancer effects through induced programed cell death on C6 glioma cells
Journal of Biomedical Materials Research Part A 2013 （IF=3.231）
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