-20℃ 避光

1.探针长期不用可以-20℃保存。避免反复冻融。
2.探针为DMSO溶液，冬季气温较低时为凝固状态，极易粘附在管壁、吸头壁。注意需要加热融解，变成液体状态后离心至管底部再开盖。
3.可以用手捂住使其融解或37℃短时间水浴。吸头也需要放在培养箱预热，否者容易再次凝固在吸头内壁产生损耗。
4.试剂拆封后请尽快使用完！

6个月

1.荧光分光光度计或荧光酶标仪，荧光显微镜等

1.悬浮细胞
2.贴壁细胞

1.使用方便：可用激光共聚焦显微镜直接观察、荧光分光光度计、荧光酶标仪或流式细胞仪检测；
2.背景低，灵敏度高；
3.线性范围宽，使用方便。

1.荧光分光光度计或荧光酶标仪，
流式细胞仪、激光共聚焦、荧光显微镜等
2.离心机
3.移液器
4.冰箱
5.冰盒

PBS缓冲液或者HBSS

1.离心管
2.吸头
3.一次性手套
4.荧光检测专用黑色96孔板

1.螺旋盖微量试剂管装的试剂在开盖前请短暂离心，将盖内壁上的液体收集至管底，避免开盖时液体洒落。
2.BBoxiProbe® O06荧光探针在2-8℃时是固体状态，从冰箱取出后恢复至室温，变成液体状态后离心至管底部再开盖。
3.本荧光探针在冬季气温较低时在室内时为凝固状态，极易粘附在管壁、吸头壁。注意需要加热溶解，吸头也需要放在培养箱预热，否者容易再次凝固在吸头内壁产生损耗。
4.使用前，先将本品取出回温至室温（20℃以上），并对其进行简短离心使溶液集中于管底。
5.荧光探针标记后，一定要洗净残余的未进入细胞内的探针，否则会导致背景较高。
6.探针标记完毕并洗净残余探针后，可以进行激发波长的扫描和发射波长的扫描，以确认探针的标记情况是否正常。
7.尽量缩短探针标记后到测定所用的时间，以减少各种可能的误差。
8.探针标记的时间也可以根据情况在15-60分钟内适当进行调整。
9.标记的条件因细胞种类而异，根据不同样本的实际染色结果做相应调整，在每次实验前，请先根据不同的实验要求、细胞类型、细胞的膜通透性等进行优化，确定最佳条件。以下染色操作条件仅供参考。请根据实际样本情况调整或参考文献。
10.酚红对O06荧光探针的检测有轻微干扰，需尽可能避免。
11.以下步骤仅做为参考，稀释比例和孵育时间可根据实际情况来调整。比如，对于某些细胞，如果发现未被刺激的阴性对照细胞荧光也比较强，可降低探针浓度。如果发现用感兴趣的药物刺激后荧光较弱，可升高O06探针浓度，以提高检测的灵敏度。另外，探针装载的时间也可以根据情况在15-60分钟内适当进行调整，孵育温度在4℃-37℃内调整。
12.必须使用荧光检测专用的黑色96孔板。

探针染色工作液配制：
根据样本数量，用HBSS将BBoxiProbe® O06荧光染料1000-2000倍稀释，配制成探针染色工作液。

探针标记
原位标记：仅适用于贴壁培养细胞。
1、 培养板/培养皿准备细胞样本。
2、 待细胞生长到合适丰度，去除细胞培养基，用PBS洗细胞一次。
3、 加入适量体积37℃预热的含O06探针工作液。
4、 在37℃细胞培养箱内于生长状态下避光孵育20分钟～40分钟（具体孵育时间需根据细胞类型而定，需预实验优化）。
5、 移除染色液，用PBS（pH7.4）洗涤细胞3次。以充分去除未进入细胞内的O06探针。
6、 加入200 μL HBSS缓冲液。
7、 荧光酶标仪、荧光显微镜（含合适滤片）检测。最大激发/发射波长为488 nm / 516 nm。

收集后标记：悬浮细胞或贴壁细胞消化处理
1. 离心，吸除上清培养基。
2. 用PBS洗细胞一次。
3. 细胞收集后重悬浮于稀释好的37℃预热的O06探针工作液中，细胞浓度为1*106-2*107/毫升。
4. 于生长状态下37℃细胞培养箱内避光孵育20-30分钟（具体时间需根据细胞类型而定，需预实验优化）。每隔3-5分钟颠倒混匀一下，使探针和细胞充分接触。
5. 离心，吸除染色液，加入PBS（pH7.4）重悬细胞，洗涤3次。以充分去除未进入细胞内的O06探针。
6. 用HBSS/PBS/无血清细胞培养基重悬细胞。
7. 用荧光光度计、荧光酶标仪、流式细胞仪检测。
最大激发/发射波长为488 nm / 516 nm。

活性氧检测：
1. 对于原位标记探针的样品可以用荧光酶标仪检测，或者用激光共聚焦显微镜、荧光显微镜，直接拍照分析（需要有相关的荧光强度分析软件）。
2. 或收集细胞后标记探针然后用荧光分光光度计、荧光酶标仪或流式细胞仪检测。
3. 对于收集细胞后标记探针的样品可以用荧光分光光度计、荧光酶标仪或流式细胞仪检测，用激光共聚焦显微镜直接拍照分析也可以（需要有相关的荧光强度分析软件）。
4. 使用488 nm激发波长，520 nm发射波长，实时或逐时间点检测刺激前后荧光的强弱。
探针O06的荧光光谱和FITC非常相似，可以用FITC的参数设置检测。
5. 荧光强度强，活性氧含量高。

1.活性氧结果如何分析？
ROS是多种物质的统称，不像某一单一活性氧指标，无法检测其绝对的含量，只能通过设置参照样本，以参照样本的倍数来反映目标样本相对含量变化，这个“相对”是针对参照的。分析结果是定性的，也是没有单位的，因为它本质上是一个比值（目标/参照）。反映的是模型样本通过具体的干预措施（如养分缺失、缺氧、药物治疗或遗传基因操控等）如何影响其ROS的变化，测定其ROS是增加或者降低了。

2.荧光照片如何分析？
需要有相关的荧光强度分析软件。ROS表达水平直接通过荧光信号的强弱和分布范围来体现。
有的显微镜扫描下来的图像本身就可以测面积和强度，可以同时测不同颜色的荧光强度。有的显微镜不支持此功能，可以将荧光染色彩色图像转换为黑白的灰度图，然后再以灰度值作为测量指标进行分析。
要结合明场的照片具体分析。如果细胞分布均匀可以算固定面积荧光强度。成像时中心和四周有差异时，一般将四周剪切掉也可以。如果细胞分布不匀，需要找到细胞分布匀称的视野，一个视野一个视野找。
如果要用图片做结果，就要平行做多个图片，作分析，统计，每张都要求荧光分布尽量一致。
为了去除杂光的影响，可以适当调节统计荧光的强度范围，将信号过弱的背景杂光去除掉。对照组和实验组整张图片需要做同样的处理，保证所有参数均要一致。
对于不同情况荧光强度的统计方法，根据实验需要或参考文献。可以算等面积的平均强度；也可以算阈值高于一定值的平均强度；也可以算荧光的累积而不算平均。要根据课题需要选择合适的测量统计方法。

1. Gang Zhong et al.
Dopamine-melanin nanoparticles scavenge reactive oxygen and nitrogen species and activate autophagy for osteoarthritis therapy
Nanoscale 2019 （IF=7.233）

2.Jing Zhao et al.
In vitro Characterization of the Rapid Cytotoxicity of Anticancer Peptide HPRP-A2 through Membrane Destruction and Intracellular Mechanism against Gastric Cancer Cell Lines
PloS one 2015 （IF=3.057）

3.Gang Wang et al.
PEG2000-DPSE-coated quercetin nanoparticles remarkably enhanced anticancer effects through induced programed cell death on C6 glioma cells
Journal of Biomedical Materials Research Part A 2013 （IF=3.231）