

贝博® 细胞外囊泡(Extracellular Vesicles)提取试剂盒(血清/血浆用用)适用于从血清/血浆用样品中提取细胞外囊泡。不需要超速离心,仅需通过简单的常规离心即可从样本中获取大量结构完整的囊泡,具有快速简单,提取效率高的特点,可节省更多的实验时间和样本。提取的囊泡可根据实验目的用于后续的多种实验,应用范围广泛。
细胞外囊泡(Extracellular Vesicles, EVs)是指从细胞膜上脱落或者由细胞分泌的双层膜结构的囊泡状小体,直径从40 nm到1000 nm不等。是细胞激活、损伤或凋亡后从细胞膜脱落或者与细胞膜融合后以外分泌的形式释放到细胞外的小囊泡。
细胞外囊泡广泛存在于细胞培养上清以及各种体液(血液、淋巴液、唾液、尿液、精液、乳汁)中,携带有细胞来源相关的多种蛋白质、脂类、DNA、mRNA、miRNA等,并且能够通过生物屏障,在细胞间传递功能性核酸分子,从而发挥各种生物学功能,参与细胞间通讯、细胞迁移、血管新生和免疫调节等过程。
囊泡已经成为细胞间通讯的重要介质,参与原核生物和高等真核生物细胞之间的生物信号传递,以调节不同范围的生物过程。囊泡的病理生理作用开始在包括癌症、感染性疾病和神经变性疾病在内的疾病中得到充分认识,在糖尿病、心血管疾病、艾滋病、慢性炎症疾病以及癌症中都发现细胞外囊泡水平的升高,它们很有可能成为这类疾病的诊断标志物,显现了囊泡作为疾病的早期诊断、治疗干预的潜在新靶点的巨大应用前景。此外,未修饰和工程化的囊泡可能在大分子药物递送中具有应用价值。因此,对细胞外囊泡进行准确的定性和定量研究显得尤为重要。
传统的血清/血浆中分离和提取微囊泡的主要方法是超速离心法,这种方法缺点是耗时耗力,往往需要30-70个小时,每次最多只能处理6个样品,需要大量的起始材料,而且产量不高。
贝博® 生物自主开发的囊泡快速提取试剂盒系列产品,可以通过简单离心快速高效获得高纯度囊泡颗粒。本试剂盒提取的囊泡完好无缺,能用于各种功能研究、蛋白分析及RNA分析、电镜分析、NTA粒径分析等下游实验应用。
本试剂盒按每个样本处理2 ml血清/血浆用计,每个50T试剂盒大约可以用于提取100ml血清/血浆。如果需要处理大量的血清/血浆,将提取液按血清/血浆体积的1:1加入血清/血浆即可。
贝博® BBcellProbe® 可以提供各种细胞分析试剂盒。包括细胞凋亡、铁死亡、铜死亡、细胞自噬、衰老、焦亡、活性、增殖、毒性、活性氧、周期、细胞代谢、信号传导、氧化应激、膜流动性、膜电位、膜通透性转换孔、细胞耗氧率、胞外酸化、糖酵解、缺氧、细胞内pH、细胞粘附、细胞形态、生长、分化、迁移等数百种细胞检测试剂盒产品。
2. 试剂拆封后请尽快使用完!
2. 纯度高,富集量大,应用范围广;
3. 获取的囊泡结构和功能完整;
4. 稳定性好,便于运输,便于保存。
2. 移液器
3. 冰箱
4. 冰盒
2. 吸头
3. 5 ml离心管
4. 一次性手套
1. 以下以2 ml血清/血浆为例,实际操作时按血清/血浆样本和提取液用量体积比等比例调整使用即可。
2. 不同细胞分泌的囊泡数量差异极大,请根据实际情况选择培养基样品的量,根据下游应用和参考文献确定。条件允许的情况下采用尽可能多的血清/血浆。
3. 条件允许的情况下采用尽可能多的血清/血浆。
4. 条件允许的情况下可以将血清/血浆浓缩后再提取囊泡。
5. 已经分离好的囊泡样本如果需要进行电镜观察,只能冰上或4℃保存,存放时间不超过两天,注意不可冷冻保存,否则可能会影响电镜观察效果。
1. 用缓冲液或纯水进行预清洗。
2. 离心管中的过滤膜一旦润湿后应避免变干。如果在预清洗后不是立即使用,则让液体保留在滤膜上,直到使用前移除并稍微离心甩干。
样品处理:
1. 收集2 ml待提取的血清/血浆样品,置2-8℃保存。
2. 将样品在4℃条件下,3000×g离心15分钟。弃沉淀,收集上清。
3. 小心将上清移入另一干净离心管中。
4. 将样品在4℃条件下,10000×g离心20分钟。弃沉淀,收集上清。
5. 得到待提取血清/血浆(I)。
囊泡提取:
6. 套上囊泡纯化离心管C(小)的液体收集外管,将待提取血清/血浆(I)吸入囊泡纯化离心管C(小)的离心管(内管)中,在4℃,10000×g条件下离心10-15分钟。
7. 吸取囊泡纯化离心管C(小)的收集管中的液体至一个干净的5 ml离心管,得到待提取血清/血浆(II)。
8. 在2 ml待提取血清/血浆(II)中加入2 ml提取液A,盖紧离心管盖。
9. 轻轻上下颠倒混匀1分钟左右,使液体充分混匀。制备成4 ml待提取血清/血浆囊泡悬液(III)。然后进行下列囊泡纯化步骤操作。
囊泡纯化:
1. 将囊泡纯化离心管D(大)内管插入所提供的一个配套离心管中。
2. 将盖好盖子的囊泡纯化离心管放入离心转子中,用一个类似的离心管平衡。
3. 以4000×g离心约10-15分钟。离心至大约剩余50 μl-100 μl液体。
4. 在50-100 μl残余液体中加入2 ml囊泡提取液B。
5. 以4000×g离心约10-15分钟。离心至大约剩余50 μl-100 μl液体。
6. 离心结束后将整个离心管从离心机中取出,取出内管。
7. 为了回收纯化后的囊泡,用200 μl移液器插入纯化管的底部,吸出纯化后的50-100 μl纯化囊泡。
8. 即得到囊泡样品纯品。
9. 用纯水或缓冲液洗涤两种大小的内管和收集管,继续纯化下一个样品。
囊泡纯化离心管D(大)清洗和保存:
1. 使用后用水冲洗干净;
2. 内管加入超纯水4 ml,4000×g离心5分钟;
3. 吸净内管中的水,加入4 ml 0.1 M NaOH,4000×g离心20分钟;
4. 用0.1 M NaOH 浸泡24小时;
5. 用水冲洗干净;
6. 用无菌水浸泡2-8℃保存。
7. 外管用自来水洗净后,用超纯水冲洗干净,晾干。
没有,该检测属于定性检测。
2. 蛋白浓度低?
很多细胞囊泡量不够下游应用,在条件允许的情况请尽可能加大培养上清的上样量。
处理部分样本时可能没有裂解完全,导致蛋白浓度低。请选择高质量的蛋白裂解液或蛋白提取试剂盒。
3. 抽提得到的RNA浓度低?
很多样本囊泡量不够下游应用,在条件允许的情况请尽可能加大样本的上样量。
4. 囊泡纯化管内管膜会因为离心时间过长而变干么?
不会,因为内管有死体积,总会有溶液残留在内管中。死体积大约10-20 μl。
5. 可以重复使用过滤管么?
可以重复使用。如果使用、清洗、保存得当,可以反复使用多次。但是超过8次重复使用后过滤膜有破损风险,注意使用过程中尽量避免尖锐物品戳到膜。离心力不要过大。
6. 囊泡在纯化时出现了沉淀,如何改进?
如果过滤过快或者过度浓缩都有可能引起沉淀。如果样品的囊泡浓度很高,建议降低最终的囊泡浓度,保留更多的液体。
对于因过滤速度敏感而导致的沉淀,建议的改进方法是:
1)离心力降低30%-50%
2)在过滤过程中取出过滤管,用枪头反复吹吸几次。
7. 有时候用囊泡纯化离心管连水都离不下来,可能是什么原因?
如果出现这种情况,可能时过滤膜的孔被堵住。请先用0.1M NaOH清洗再离心。最后用缓冲液或纯水再次清洗后甩干。清洗后的滤膜应立即使用,如暂时不用,请保持润湿状态,避免重新干燥。
8. 说明书中推荐在室温下进行离心,考虑到囊泡的稳定性,是否可以在4℃进行离心?
可以,但是低温可能会增加囊泡样品的粘性,导致流速减慢,建议可将离心时间延长。
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