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产品概述
product description
贝博® BBcellProbe® 冰冻切片游离胆固醇Filipin 染色试剂盒是采用F53游离胆固醇荧光探针染色游离胆固醇的试剂盒。
BBcellProbe® F53 （Filipin游离胆固醇荧光探针）是一种基于多烯大环内酯结构的荧光探针，可以特异性与细胞膜中的游离胆固醇（非酯化形式）结合，形成荧光复合物。在紫外光激发下产生特征性蓝色荧光，应用于组织/细胞样本中的细胞膜中游离胆固醇的定位与定量分析。
保存温度
2-8℃避光
注意事项
1.试剂A短期4℃避光保存，长期-20℃避光保存；避免反复冻融。
2.试剂A在冬季气温较低时在室温时为凝固状态，极易粘附在管壁、吸头壁。注意需要加热融解，吸头也需要放在培养箱预热，否者容易再次凝固在吸头内壁产生损耗。融解后离心至管底部再打开螺旋盖。可以用手捂住使其融解或37℃短时间水浴。
2.试剂A在冬季气温较低时在室温时为凝固状态，极易粘附在管壁、吸头壁。注意需要加热融解，吸头也需要放在培养箱预热，否者容易再次凝固在吸头内壁产生损耗。融解后离心至管底部再打开螺旋盖。可以用手捂住使其融解或37℃短时间水浴。
有效期
6个月
检测方法
激光共聚焦显微镜
适用样本
冰冻切片
仪器准备
1.共聚焦显微镜（带紫外激发通道）
2.冰冻切片机（切片厚度 8~10μm）
3.摇床（低速）
4.移液器
5.冰箱
6.冰盒
2.冰冻切片机（切片厚度 8~10μm）
3.摇床（低速）
4.移液器
5.冰箱
6.冰盒
试剂准备
1.PBS缓冲液
2.生理盐水
3.纯水
2.生理盐水
3.纯水
耗材准备
1.防脱片载玻片（冰冻切片专用）、盖玻片、；
2.吸头（无酶无胆固醇）
3.一次性手套
4.避光湿盒、锡箔纸、染色缸
2.吸头（无酶无胆固醇）
3.一次性手套
4.避光湿盒、锡箔纸、染色缸
使用注意事项
1. F53试剂避光保存，使用过程中尽量避光。
2. 全程避光操作、避免脂溶性试剂抽提胆固醇、防止切片脱片。
3. 所有试剂均使用无胆固醇的超纯水 / 试剂配制，避免外源性胆固醇污染。
4. 洗片均为低速摇床振荡。
5. 部分组织（如弹力纤维、红细胞、脂褐素）有自发荧光，可通过设置对照和使用合适的滤片加以区分。脂褐素的自发荧光谱较宽，在多个通道可见，而F53信号主要在蓝光范围。
2. 全程避光操作、避免脂溶性试剂抽提胆固醇、防止切片脱片。
3. 所有试剂均使用无胆固醇的超纯水 / 试剂配制，避免外源性胆固醇污染。
4. 洗片均为低速摇床振荡。
5. 部分组织（如弹力纤维、红细胞、脂褐素）有自发荧光，可通过设置对照和使用合适的滤片加以区分。脂褐素的自发荧光谱较宽，在多个通道可见，而F53信号主要在蓝光范围。
使用方法
试剂配制：
临用前，根据样本数量，取 10μL F53储存液A，加入 990μL 染色缓冲液B，涡旋充分混匀。
样本制备：
1. 冰冻切片为8~10μm 厚，贴于防脱片载玻片后。
2. 室温通风干燥10~15min，使切片与载玻片紧密结合，防止后续洗片脱片；
染色步骤：
1. 洗去 OCT 包埋剂：将干燥后的切片置于染色缸中。
2. 加入 0.01mol/L PBS，洗涤 3 次，每次 5min，充分洗去冰冻切片的 OCT 包埋剂，避免包埋剂干扰探针结合。
3. 温和固定：取出切片，滴加固定液D完全覆盖组织，室温固定15~20min；
4. 洗去固定液：将切片放回染色缸，0.01mol/L PBS 洗涤 3 次，每次 5min，洗去残留的固定剂，防止固定剂影响探针活性。
5. F53特异性染色：将切片置于避光湿盒中，滴加现配的 F53染色工作液，完全覆盖组织切片（避免干涸），室温避光孵育30~60min；
6. 将切片放回染色缸，用洗涤液C避光洗涤5 min。
7. 再用0.01mol/L PBS 避光洗涤 3 次，每次 5min。
8. 封片：取出切片，用吸水纸轻轻吸去组织周围的 PBS（勿触碰组织），滴加 1~2 滴抗荧光淬灭封片剂，缓慢盖上盖玻片，避免产生气泡。
9. 封片后处理：盖玻片边缘可涂抹少量指甲油密封，4℃避光保存，建议当天完成荧光观察 / 拍照，避免荧光淬灭。
荧光观察与拍照
激发 / 发射波长：F53探针胆固醇复合物的激发波长 350~380nm（紫外光通道），发射波长 440~460nm（蓝色荧光）。
结果：
阳性信号： 在高游离胆固醇区域会显示明亮的蓝色/蓝白色颗粒状或斑片状荧光。
阴性区域： 仅显示微弱的组织自发荧光或无荧光。
背景： 良好的染色应具有清晰的信号和低背景。
临用前，根据样本数量，取 10μL F53储存液A，加入 990μL 染色缓冲液B，涡旋充分混匀。
样本制备：
1. 冰冻切片为8~10μm 厚，贴于防脱片载玻片后。
2. 室温通风干燥10~15min，使切片与载玻片紧密结合，防止后续洗片脱片；
染色步骤：
1. 洗去 OCT 包埋剂：将干燥后的切片置于染色缸中。
2. 加入 0.01mol/L PBS，洗涤 3 次，每次 5min，充分洗去冰冻切片的 OCT 包埋剂，避免包埋剂干扰探针结合。
3. 温和固定：取出切片，滴加固定液D完全覆盖组织，室温固定15~20min；
4. 洗去固定液：将切片放回染色缸，0.01mol/L PBS 洗涤 3 次，每次 5min，洗去残留的固定剂，防止固定剂影响探针活性。
5. F53特异性染色：将切片置于避光湿盒中，滴加现配的 F53染色工作液，完全覆盖组织切片（避免干涸），室温避光孵育30~60min；
6. 将切片放回染色缸，用洗涤液C避光洗涤5 min。
7. 再用0.01mol/L PBS 避光洗涤 3 次，每次 5min。
8. 封片：取出切片，用吸水纸轻轻吸去组织周围的 PBS（勿触碰组织），滴加 1~2 滴抗荧光淬灭封片剂，缓慢盖上盖玻片，避免产生气泡。
9. 封片后处理：盖玻片边缘可涂抹少量指甲油密封，4℃避光保存，建议当天完成荧光观察 / 拍照，避免荧光淬灭。
荧光观察与拍照
激发 / 发射波长：F53探针胆固醇复合物的激发波长 350~380nm（紫外光通道），发射波长 440~460nm（蓝色荧光）。
结果：
阳性信号： 在高游离胆固醇区域会显示明亮的蓝色/蓝白色颗粒状或斑片状荧光。
阴性区域： 仅显示微弱的组织自发荧光或无荧光。
背景： 良好的染色应具有清晰的信号和低背景。
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