2-8℃避光

1.有效期为试剂盒未拆封前按要求条件保存的有效期。
2.试剂拆封后请尽快使用完！

3个月（注意：里面的孵育液是一次性配完，一周内有效！）

显微镜

1. 石蜡切片
2. 冰冻切片
3. 细胞涂片，爬片
4.血涂片等

1光学显微镜
2.染缸
3.移液器
4.秒表
5.冰盒

纯水

1.载玻片
2.吸头
3.一次性手套

1.TRAP孵育液易失效，本法宜用皮肤穿刺血涂片，晾干后应及时染色；
2.对冰冻切片染色时，应减少切片在室温暴露的时间。
3.样本需新鲜，取材后应立即处理，否则会影响酶的活性。
4.组织固定需在4℃冰箱进行，时间不宜超过24h，否则酶活性会减弱或消失。
5.一般不建议用石蜡切片。如果需要用石蜡切片，组织在石蜡包埋时，温度不宜高于56℃。应使用熔点为52～54℃的石蜡进行浸蜡，浸蜡时间要短，否则酶活性会减弱或消失。
6.石蜡切片不需要固定。

（注意：里面的孵育液是一次性配完，一周内有效！）
注意：其他工作液请使用前新鲜配制，配制后立即使用，一次使用完，不可放置。

样本的染色处理：
一、血涂片及骨髓涂片
1、推片：
取全血或骨髓3ul左右置载玻片上，将推玻片保持与载玻片30°角，置于血滴正前方，稍微往后移与血滴接触，血滴沿推片下缘散开，再匀速沿载玻片平面平稳向前滑动，至血滴铺完血膜为止。不要太薄，以免细胞太少，也不要太厚，以免太重叠。
2、固定：
让涂片在空气中自然晾干，再放入本试剂盒中的固定液A中固定2-3分钟，水洗30-60秒。
3、孵育：
水洗后还未完全干前放入底物孵育液中避光孵育60分钟。太干后染色效果会变差。
4、复染：
孵育完后，取出水洗1分钟，在玻片未完全干前进行复染。可用苏木素复染1-2分钟，或者用甲基绿复染2-3分钟，两者任选其一即可。

二、细胞涂片及细胞爬片
1、固定：
将细胞涂片或细胞爬片放入本试剂盒中的固定液A中固定2-3分钟，水洗30-60秒。
2、孵育：
水洗后还未完全干前放入底物孵育液中避光孵育60分钟。太干后染色效果会变差。
3、复染：
孵育完后，取出水洗1分钟，在玻片未完全干前进行复染。可用苏木素复染1-2分钟，或者用甲基绿复染2-3分钟，两者任选其一即可。

三、冰冻切片
1、回温：
将保存在-20℃冰箱中的冰冻切片放置到切片架上回温5-10分钟。可以放在37℃孵箱中进行回温，或者将切片架放置在一个小盒子中，将盒子置于37℃水浴锅中进行回温。
2、水合：
将回温好的切片，水中浸泡1-2分钟。
3、固定：
让切片在空气中自然晾干，再放入本试剂盒中的固定液中固定2-3分钟，水洗30-60秒。
4、孵育：
水洗后还未完全干前放入底物孵育液中避光孵育60分钟。太干后染色效果会变差。
5、复染：
孵育完后，取出水洗1分钟，在玻片未完全干前进行复染。可用苏木素复染1-2分钟，或者用甲基绿复染2-3分钟，两者任选其一即可。

四、石蜡切片
1、脱蜡：
二甲苯中脱蜡5-10分钟。再换用新鲜的二甲苯脱蜡5-10分钟。
2、浸泡：
无水乙醇浸泡5分钟。再分别用90%、70%乙醇各2分钟。
3、水合：
蒸馏水中浸泡2分钟。
4、孵育：
还未完全干前放入底物孵育液中避光孵育60分钟。太干后染色效果会变差。
5、复染：
孵育完后，取出水洗1分钟，在玻片未完全干前进行复染。可用苏木素复染1-2分钟，或者用甲基绿复染2-3分钟，两者任选其一即可。

结果分析：
阳性反应为鲜红色或深红色颗粒，定位于胞浆中。

1细胞诱导不成功？
细胞系或原代BMM细胞诱导破骨细胞时，细胞因子的质量很重要。诱导效果不好时可以考虑调整诱导条件，提高RANKL浓度或者尝试是否添加M-CSF。

2.如何判断阳性细胞？
一般不通过形态变化说明，RAW细胞非常形态非常多样，形态变化并不能说明问题。一般认为多核加上TRAP阳性才能说是多核破骨细胞。

1.Guiping Chen et al.
Bergapten suppresses RANKL-induced osteoclastogenesis and ovariectomy-induced osteoporosis via suppression of NF-κB and JNK signaling pathways
Biochemical and Biophysical Research Communications 2019

2.Wen‑Yong Fei et al.
Magnolol prevents ovariectomy‑induced bone loss by suppressing osteoclastogenesis via inhibition of the nuclear factor‑κB and mitogen‑activated protein kinase pathways
International Journal of Molecular Medicine 2019