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产品概述
product description
贝博® BBoneBot® XTT细胞增殖及细胞毒性检测试剂盒是应用二甲氧唑黄2,3-bis[2-methoxy-4-nitro-5-sulfophenyl]-5-[(phenylamino)carbonyl]-2H-tetrazolium hydroxide快速高灵敏度检测细胞增殖和细胞毒性的比色检测产品。 XTT在电子耦合试剂存在的情况下能够被线粒体内的一些与辅酶Ⅱ相关的脱氢酶还原成橙黄色的水溶性的Formazan，生成的Formazan量与活细胞数量成正比。细胞增殖越多越快，则颜色越深；细胞毒性越大，则颜色越浅。对于同样的细胞，颜色的深浅和细胞数量呈线性关系。 本XTT试剂为配制好的即用型试剂，直接加入到细胞样品中，不需要预配各种成分，XTT试剂很稳定，对细胞没有毒性，可以长时间孵育细胞。XTT法测定细胞增殖或毒性试验中活细胞数目的灵敏度高，无放射性，检测细胞增殖实验的灵敏度比其它方法如MTT高。 贝博® BBcellProbe® 可以提供细胞凋亡、增殖、毒性、活性氧、细胞代谢、氧化应激、细胞膜流动性、膜通透性转换孔、细胞耗氧率、细胞内pH、细胞粘附、细胞自噬等数百种检测试剂盒产品。
保存温度
2-8℃避光
注意事项
1.需要长期保存可以分装后-20℃保存.
2.避免反复冻融。
3.冻存后融解时注意重新充分混匀。
4.试剂拆封后请尽快使用完！
2.避免反复冻融。
3.冻存后融解时注意重新充分混匀。
4.试剂拆封后请尽快使用完！
有效期
一年
检测方法
酶标仪
适用样本
动物细胞
产品特点
1.使用方便：仅使用单一试剂；
2.灵敏度高，数据可靠，重现性好，线性范围更宽；
3.结果稳定：试剂本身稳定性高，实验结果稳定可靠；
4.无需放射性同位素和有机溶剂，对细胞毒性低；
5.适合于高通量药物筛选。
2.灵敏度高，数据可靠，重现性好，线性范围更宽；
3.结果稳定：试剂本身稳定性高，实验结果稳定可靠；
4.无需放射性同位素和有机溶剂，对细胞毒性低；
5.适合于高通量药物筛选。
产品应用
酶标仪
仪器准备
1.带有450nm滤光片的酶标仪 2. CO2培养箱
试剂准备
1.PBS 2.纯水
耗材准备
1.移液器及吸头 2.96孔培养板
使用注意事项
1.旋帽离心管装的试剂在开盖前请短暂离心，将盖内壁上的液体甩至管底，避免开盖时液体洒落。
2.需长时间保存可-20℃避光保存。避免反复冻融，否则将会增加空白吸收，从而影响检测结果。最好小剂量分装，用避光袋或是黑纸、锡箔纸包住避光。
3.正式实验前，建议先做几个孔摸索接种细胞的数量和加入XTT试剂后的培养时间。在1000-100000之间摸细胞数量。
4.部分药物可能对检测有影响，有影响时需换液后检测，无影响时直接检测。用培养基或PBS来配制待检测药物，加入XTT试剂，测药物溶液在450 nm处的吸光度。如果该吸光度与不含药物仅加XTT试剂的培养基或PBS吸光度差异不大，则可以直接加入XTT，如果吸光度相对较大，则需要除去培养基，并用新鲜培养基洗涤细胞两次，然后加入新的100 μl培养基和10 μl XTT进行检测。
5.如果样品为高浑浊度的细胞悬液，或者为了去除其它颜色物质的影响，建议设定600 nm (或600 nm以上) 作为参比波长，以OD450扣除参比波长的O.D值即可。
6.接种时注意细胞悬液一定要混匀，以避免细胞沉淀下来，导致每孔中的细胞数量不等，可以每接种几个孔就混匀一下。培养板周围一圈孔培养基容易挥发，为了减少误差，建议培养板的四边每孔只加培养基，而不作为指标检测孔。
2.需长时间保存可-20℃避光保存。避免反复冻融，否则将会增加空白吸收，从而影响检测结果。最好小剂量分装，用避光袋或是黑纸、锡箔纸包住避光。
3.正式实验前，建议先做几个孔摸索接种细胞的数量和加入XTT试剂后的培养时间。在1000-100000之间摸细胞数量。
4.部分药物可能对检测有影响，有影响时需换液后检测，无影响时直接检测。用培养基或PBS来配制待检测药物，加入XTT试剂，测药物溶液在450 nm处的吸光度。如果该吸光度与不含药物仅加XTT试剂的培养基或PBS吸光度差异不大，则可以直接加入XTT，如果吸光度相对较大，则需要除去培养基，并用新鲜培养基洗涤细胞两次，然后加入新的100 μl培养基和10 μl XTT进行检测。
5.如果样品为高浑浊度的细胞悬液，或者为了去除其它颜色物质的影响，建议设定600 nm (或600 nm以上) 作为参比波长，以OD450扣除参比波长的O.D值即可。
6.接种时注意细胞悬液一定要混匀，以避免细胞沉淀下来，导致每孔中的细胞数量不等，可以每接种几个孔就混匀一下。培养板周围一圈孔培养基容易挥发，为了减少误差，建议培养板的四边每孔只加培养基，而不作为指标检测孔。
使用方法
细胞活性、细胞增殖-毒性检测
1. 收集细胞，加细胞悬液100 μl（约5000-10000个细胞）到96孔板（边缘孔用无菌水或PBS填充）。每板设对照（加100l培养基）。
2. 置37℃，5% CO2孵育过夜，倒置显微镜下观察。
3. 每孔加入10 μl 待检测药物溶液， 37℃孵育。
4. 每孔加入10 μl XTT试剂，37℃孵育1-4 小时。
5. 测定450 nm各孔的吸光值，如无450nm滤光片，可以使用450-490nm的滤光片。同时设置空白孔（培养基和XTT试剂，无细胞），对照孔（不加药培养基和XTT试剂，有细胞），每组设定3-5复孔。
细胞活力计算：
将各测试孔的OD值减去调零孔OD值或对照孔OD值。各重复孔的OD值取平均数。
细胞活力% =（加药细胞OD-空白OD/对照细胞OD-空白OD）×100
细胞数量测定
1. 先用细胞计数板计数所制备的细胞悬液中的细胞数量，然后接种细胞。
2. 按比例 (例如：1/2比例) 依次用培养基等比稀释成一个细胞浓度梯度，一般要做3-5个细胞浓度梯度，每组3-6个复孔。
3. 接种后培养2-4小时使细胞贴壁，然后加XTT试剂培养一定时间后测定O.D值，制作出一条以细胞数量为横坐标 (X轴)，O.D值为纵坐标 (Y轴) 的标准曲线。根据此标准曲线可以测定出未知样品的细胞数量 (使用此标准曲线的前提条件是实验的条件要一致，便于确定细胞的接种数量以及加入XTT试剂后的培养时间)。
1. 收集细胞，加细胞悬液100 μl（约5000-10000个细胞）到96孔板（边缘孔用无菌水或PBS填充）。每板设对照（加100l培养基）。
2. 置37℃，5% CO2孵育过夜，倒置显微镜下观察。
3. 每孔加入10 μl 待检测药物溶液， 37℃孵育。
4. 每孔加入10 μl XTT试剂，37℃孵育1-4 小时。
5. 测定450 nm各孔的吸光值，如无450nm滤光片，可以使用450-490nm的滤光片。同时设置空白孔（培养基和XTT试剂，无细胞），对照孔（不加药培养基和XTT试剂，有细胞），每组设定3-5复孔。
细胞活力计算：
将各测试孔的OD值减去调零孔OD值或对照孔OD值。各重复孔的OD值取平均数。
细胞活力% =（加药细胞OD-空白OD/对照细胞OD-空白OD）×100
细胞数量测定
1. 先用细胞计数板计数所制备的细胞悬液中的细胞数量，然后接种细胞。
2. 按比例 (例如：1/2比例) 依次用培养基等比稀释成一个细胞浓度梯度，一般要做3-5个细胞浓度梯度，每组3-6个复孔。
3. 接种后培养2-4小时使细胞贴壁，然后加XTT试剂培养一定时间后测定O.D值，制作出一条以细胞数量为横坐标 (X轴)，O.D值为纵坐标 (Y轴) 的标准曲线。根据此标准曲线可以测定出未知样品的细胞数量 (使用此标准曲线的前提条件是实验的条件要一致，便于确定细胞的接种数量以及加入XTT试剂后的培养时间)。
常见问题分析
1.检测时需要换液吗？
如果待测药物有还原性，需要换液，否则不需要。
2.如何判断待测药物是否含有还原性？
测定不含细胞，仅含有待测药物的溶液加入XTT反应后的在490 nm处的空白吸光度。如果该吸光度很小，说明待测药物没有还原性或还原性很小，对XTT没有影响，则可以不换液，在培养基中直接加入XTT ；如果吸光度相对较大，说明药物具有较强的还原性，则需要除去含药物的培养基，并用新鲜培养基洗涤细胞两次，然后加入新的100 μl培养基和10 μl XTT进行检测。
如果待测药物有还原性，需要换液，否则不需要。
2.如何判断待测药物是否含有还原性？
测定不含细胞，仅含有待测药物的溶液加入XTT反应后的在490 nm处的空白吸光度。如果该吸光度很小，说明待测药物没有还原性或还原性很小，对XTT没有影响，则可以不换液，在培养基中直接加入XTT ；如果吸光度相对较大，说明药物具有较强的还原性，则需要除去含药物的培养基，并用新鲜培养基洗涤细胞两次，然后加入新的100 μl培养基和10 μl XTT进行检测。
参考文献
1.Ying Li, et al.
Natural product solasodine-3-O-β-D-glucopyranoside inhibits the virulence factors of Candida albicans
FEMS Yeast Research 2015
Natural product solasodine-3-O-β-D-glucopyranoside inhibits the virulence factors of Candida albicans
FEMS Yeast Research 2015
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