2-8℃避光

1.染色液2-8℃避光保存；
2.需要长期保存可以分装后-20℃保存，避免反复冻融。
3.溶解液室温保存。

一年

酶标仪

动物细胞

酶标仪

1.带有450nm滤光片的酶标仪 2. CO2培养箱

1.PBS 2.纯水

1.移液器及吸头 2.96孔培养板

1.需长时间保存可-20℃避光保存。避免反复冻融，否则将会增加空白吸收，从而影响检测结果。最好小剂量分装，用避光袋或是黑纸、锡箔纸包住避光。
2.还原的MTT在460-630均有较好的吸收，如果你的酶标仪是滤光片，可以选470 nm左右或630 nm左右的滤光片，如果酶标仪有单波长，你可以在检测前扫描一下吸收谱，选用最大吸收波长检测，最大波长，在550nm附近，必要时加一个参比波长以扣除非特异性吸收。
3.MTT溶液为黄色，需避光保存，长时间光照会导致失效。当颜色变为灰绿色时，请勿使用。
4.Formazan溶解液结冻或产生沉淀时可以37℃水浴孵育以促进溶解，并且必须在全部溶解并混匀后使用。
5.细胞处理需要小心操作,尽量避免人为的损伤细胞。

贴壁细胞：
1. 收集对数期细胞，每孔加入100ul细胞悬液,使待测细胞调密度约2000-10000孔。
2. 5%CO2，37℃孵育，至细胞单层铺满孔底（96孔平底板）,加入浓度梯度的药物,原则上，细胞贴壁后即可加药，也可两小时，或半天时间后加药，一般5-7个梯度,每孔100ul,设3-5个复孔。
3. 5%CO2，37℃孵育16-48小时，倒置显微镜下观察。
4. 每孔加入10ulMTT溶液，继续培养4h。若药物与MTT能够反应，可先离心后弃去培养液，小心用PBS冲2-3遍后，再加入含MTT的培养液。
5. 终止培养，小心吸去孔内培养液。
6. 每孔加入150ul溶解液，置摇床上低速振荡10min，使结晶物充分溶解。在酶标仪490nm或550nm或570nm处测量各孔的吸光值。
7. 同时设置调零孔（培养基、MTT、溶解液），对照孔（细胞、相同浓度的药物溶解介质、培养液、MTT、溶解液） 悬浮细胞：
1. 收集对数期细胞，调节细胞悬液浓度1×106/ml，按次序将补足的无血清培养基40ul、需检测药物10ul、细胞悬液50ul（即5×104细胞/孔），共100ul加入到96孔板（边缘孔用无菌水或PBS填充）。每板设对照（加100l培养基）。
2. 置37℃，5%CO2孵育16-48小时，倒置显微镜下观察。
3. 每孔加入10 ul MTT溶液，继续培养4 h。
4. 离心（1000转x10min），小心吸掉上清，每孔加入100 ul溶解液，置摇床上低速振荡10 min，使结晶物充分溶解。490nm或550nm或570nm处测量各孔的吸光值。
5. 同时设置调零孔（培养基、MTT、溶解液），对照孔（细胞、相同浓度的药物溶解介质、培养液、MTT、溶解液），每组设定3-5复孔。 结果分析 ：
细胞的存活率：将各测试孔的OD值减去调零孔OD值或对照孔OD值。各重复孔的OD值取均数±SD。
细胞的存活率以T/C%表示，T为加药细胞的OD值，C为对照细胞的OD值。
细胞存活率% =（加药细胞OD/对照细胞OD）×100