2-8℃避光

1.长期不用可以-20℃保存。
2.Annexin V-APC染色液避免反复冻融。多次冻融会导致失效。
3.Annexin V-APC染色液需要长期保存时可以根据使用情况进行小量分装后-20℃保存。
4.试剂拆封后请尽快使用完！

1年

1.流式细胞仪
2.激光共聚焦
3.荧光显微镜

1.悬浮细胞
2.贴壁细胞

1.方便：可用流式细胞仪或荧光显微镜检测；
2.快速：1小时内即可完成实验；
3.准确：能准确区分活细胞、凋亡细胞和坏死细胞，并计数各群细胞的比例。

1.流式细胞仪
2.激光共聚焦
3.荧光显微镜

1.流式细胞仪或荧光显微镜或激光共聚焦
2.离心机
3.移液器
4.冰箱
5.冰盒

1.PBS 缓冲液（pH7.4，实验室常用的10mM磷酸缓冲盐溶液（1X））
2.或者HBSS（Hank's Balanced Salt Solution）

1.离心管
2.吸头
3.一次性手套
4.铝箔

1.螺旋盖微量试剂管装的试剂在开盖前请短暂离心，将盖内壁上的液体收集至管底，避免开盖时液体损失导致试剂量不够用。
2.细胞处理需要小心操作,尽量避免人为的损伤细胞。离心力在不损失细胞的前提下尽可能小，重悬细胞是动作要轻柔，避免多次反复的激烈吹打。不用涡旋振荡器。
3.Annexin V-FITC（等）和Propidium iodide（等）是光敏物质，在操作时请注意避光，尽量减少它们暴露在光下的时间。有必要时可以使用带盖子的冰盒或铝箔纸避光。标记后将细胞保持在避光环境中。移液过程中短暂暴露在光线下（<30秒）是可以接受的。
4.由于细胞凋亡是一个快速和动态的过程，因此最好在染色后立即进行分析。
5.使用Annexin V-FITC（等） 试剂盒检测凋亡需要针对活细胞。不要固定细胞，固定操作会对结果产生干扰。

样品染色：
1. 离心收集悬浮细胞。离心机300×g -500×g力，2-8°C，离心时间5分钟，弃培养基。
2. 用冷PBS洗涤细胞两次。（300×g -400×g，2-8°C，离心时间5分钟收集细胞）。
3. 用100 μl 1X Annexin V结合液悬浮细胞，浓度大约为1-5 X 106 cells/ml。
4. 在细胞悬浮液中加入5 μl Annexin V-APC染色液，轻轻混匀后于2-8°C避光条件下孵育5-15分钟。
5. 加入PI（或7-AAD）染色液后轻轻混匀于2-8°C避光条件下孵育1-3分钟。（此步骤选做，根据实验需要也可以只做APC单染）。
6. 加入400 μl PBS或1X Annexin V结合液，轻轻混匀。
7. 立即用流式细胞仪检测。

流式细胞仪分析：
经处理过的细胞此时可以在流式细胞仪上分析。
按照常规的流式凋亡检测的操作即可。
Annexin V-APC的荧光最大激发波长652 m，最大发射波长670 m；PI荧光最大激发波长535 m，最大发射波长在620 m。

上机检测前，须用待测细胞制备质控样本来设定流式细胞仪的荧光补偿和设置十字门的范围：
（I） 未转染GFP等标记的细胞
① 空白管：阴性对照组细胞，没有染色的细胞。不加Annexin V/APC，PI。用于调节电压。
② 单染管：有明显凋亡的细胞，只加Annexin V/APC染色。用于调节补偿。
③ 单染管：有明显凋亡的细胞，只加PI染色。用于调节补偿
④ 检测管：待测的处理细胞，加Annexin V/APC，PI。用空白管和单阳管调节好电压补偿后，获得所需要的流式数据。

（II） 转染GFP细胞
① 未转染空白管：未转染细胞，阴性对照组细胞，没有染色的细胞。不加Annexin V/APC，PI。用于调节电压。
② 转染GFP空白管：转染GFP的对照组细胞，没有染色的细胞。不加Annexin V/APC，PI。用于调补偿
③ 未转染单染管：未转染且有明显凋亡的细胞，只加Annexin V/APC染色。用于调节补偿。
④ 未转染单染管：未转染且有明显凋亡的细胞，只加PI染色。用于调节补偿
⑤ 检测管：待测的处理细胞，加Annexin V/APC，PI。用空白管和单阳管调节好电压补偿后，获得所需要的流式数据。

实验过程中Annexin V染不上色或阳性率偏低。可能的原因如下：
1. 用于检测的流式细胞仪/显微镜设置不当。调整使用正确的仪器设置。
2. 确定实验中的诱导剂是否能产生凋亡。可通过设定确切凋亡诱导效果的阳性药物对照来排除这一情况。
3. 细胞未启动凋亡。重新确定诱导后凋亡启动的时间点（时程实验）。
4. 细胞数量偏少。增加细胞数量。
5. 贴壁细胞消化不当。Annexin V 跟PS 的结合需要Ca2+离子，结合液中含有Ca2+，EDTA 的消化会影响染色，建议使用无EDTA 的胰酶，或者消化后用PBS洗涤干净。

实验过程中阳性率偏高。可能的原因如下：
1. 用于检测的流式细胞仪/显微镜设置不当。调整使用正确的仪器设置。
2. 细胞本身活力太差。实验中发现未经诱导凋亡的对照细胞经染色后AnnexinV+/PI+双阳性的细胞比例过高，造成这种结果的原因可能是细胞本身活力太差。建议用台盼蓝染色计算细胞的活力，台盼蓝拒染的细胞应大于95%。若活力偏低低，建议重新复苏细胞，通常刚复苏的细胞至少要传代3 次以后才能进行实验。

1.Hongjuan Li, et al.
Nucleus-targeted nano delivery system eradicates cancer stem cells by combined thermotherapy and hypoxia-activated chemotherapy
Biomaterials 2019 （IF=10.317）

2.Wei Bing, et al.
Programmed Bacteria Death Induced by Carbon Dots with Different Surface Charge
Small 2016 （IF=11.459）

3.Linchong Sun, et al.
cMyc-mediated activation of serine biosynthesis pathway is critical for cancer progression under nutrient deprivation conditions
Cell Research 2015 （IF=20.507） 4.Kerong Deng, et al.
Enhanced Antitumor Efficacy by 808 nm Laser-Induced Synergistic Photothermal and Photodynamic Therapy Based on a Indocyanine-Green-Attached W18O49 Nanostructure
Advanced Functional Materials 2015 （IF=16.836）

5.Wenqiao Zang, et al.
miR-663 attenuates tumor growth and invasiveness by targeting eEF1A2 in pancreatic cancer
Molecular Cancer 2015 （IF=15.302）