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产品概述
product description
细胞凋亡是细胞的基本特征之一，它在机体的胚胎发育、组织修复、内环境的稳定和一些疾病发生过程等方面起着十分重要的作用。 在正常细胞中，磷脂酰丝氨酸（PS）只分布在细胞膜脂质双层的内侧，而在细胞凋亡早期，细胞膜中的磷脂酰丝氨酸（PS）由脂膜内侧翻向外侧。在体内，巨噬细胞可以识别翻转到细胞膜表面的PS 从而将这些程序性死亡的细胞清除，因此凋亡过程中并不伴随局部的炎症反应，而在细胞坏死的过程中则常常伴随着炎症反应。 AnnexinⅤ是一种分子量为35-36kD的Ca2+依赖性磷脂结合蛋白，能与细胞凋亡过程中翻转到膜外的PS高亲和力特异性结合。PS 外翻发生在细胞核破裂，DNA 片段化以及凋亡相关蛋白出现之前，这使得Annexin V 与PS 的结合成为凋亡早期的一种重要检测标志事件。
保存温度
2-8℃避光
注意事项
1.长期不用可以-20℃保存。
2.Annexin V-Cy5染色液避免反复冻融。多次冻融会导致失效。
3.Annexin V-Cy5染色液需要长期保存时可以根据使用情况进行小量分装后-20℃保存。
4.试剂拆封后请尽快使用完！
2.Annexin V-Cy5染色液避免反复冻融。多次冻融会导致失效。
3.Annexin V-Cy5染色液需要长期保存时可以根据使用情况进行小量分装后-20℃保存。
4.试剂拆封后请尽快使用完！
有效期
1年
检测方法
1.流式细胞仪
2.激光共聚焦
3.荧光显微镜
2.激光共聚焦
3.荧光显微镜
适用样本
1.悬浮细胞
2.贴壁细胞
2.贴壁细胞
产品特点
1.方便：可用流式细胞仪或荧光显微镜检测；
2.快速：1小时内即可完成实验；
3.准确：能准确区分活细胞、凋亡细胞和坏死细胞，并计数各群细胞的比例。
2.快速：1小时内即可完成实验；
3.准确：能准确区分活细胞、凋亡细胞和坏死细胞，并计数各群细胞的比例。
产品应用
1.流式细胞仪
2.激光共聚焦
3.荧光显微镜
2.激光共聚焦
3.荧光显微镜
仪器准备
1.流式细胞仪或荧光显微镜或激光共聚焦
2.离心机
3.移液器
4.冰箱
5.冰盒
2.离心机
3.移液器
4.冰箱
5.冰盒
试剂准备
1.PBS 缓冲液（pH7.4，实验室常用的10mM磷酸缓冲盐溶液（1X））
2.或者HBSS（Hank's Balanced Salt Solution）
2.或者HBSS（Hank's Balanced Salt Solution）
耗材准备
1.离心管
2.吸头
3.一次性手套
4.铝箔
2.吸头
3.一次性手套
4.铝箔
使用注意事项
1.螺旋盖微量试剂管装的试剂在开盖前请短暂离心，将盖内壁上的液体收集至管底，避免开盖时液体损失导致试剂量不够用。
2.细胞处理需要小心操作,尽量避免人为的损伤细胞。离心力在不损失细胞的前提下尽可能小，重悬细胞是动作要轻柔，避免多次反复的激烈吹打。不用涡旋振荡器。
3.Annexin V-FITC（等）和Propidium iodide（等）是光敏物质，在操作时请注意避光，尽量减少它们暴露在光下的时间。有必要时可以使用带盖子的冰盒或铝箔纸避光。标记后将细胞保持在避光环境中。移液过程中短暂暴露在光线下（<30秒）是可以接受的。
4.由于细胞凋亡是一个快速和动态的过程，因此最好在染色后立即进行分析。
5.使用Annexin V-FITC（等） 试剂盒检测凋亡需要针对活细胞。不要固定细胞，固定操作会对结果产生干扰。
2.细胞处理需要小心操作,尽量避免人为的损伤细胞。离心力在不损失细胞的前提下尽可能小，重悬细胞是动作要轻柔，避免多次反复的激烈吹打。不用涡旋振荡器。
3.Annexin V-FITC（等）和Propidium iodide（等）是光敏物质，在操作时请注意避光，尽量减少它们暴露在光下的时间。有必要时可以使用带盖子的冰盒或铝箔纸避光。标记后将细胞保持在避光环境中。移液过程中短暂暴露在光线下（<30秒）是可以接受的。
4.由于细胞凋亡是一个快速和动态的过程，因此最好在染色后立即进行分析。
5.使用Annexin V-FITC（等） 试剂盒检测凋亡需要针对活细胞。不要固定细胞，固定操作会对结果产生干扰。
使用方法
样品染色：
1. 离心收集悬浮细胞。离心机300-500g力，2-8°C，离心时间5分钟，弃培养基。（贴壁细胞用不含EDTA的胰酶消化后离心，收集细胞。胰酶消化时间不宜过长，以防损伤细胞膜，引起假阳性）。
2. 用冷PBS洗涤细胞两次。
3. 用400ul 1X Annexin V结合液悬浮细胞，浓度大约为1 X 106 cells/ml。
4. 在细胞悬浮液中加入5ul Annexin V- Cy5染色液，轻轻混匀后于2-8°C避光条件下孵育15分钟。
5. 加入其它颜色的核酸染色液后轻轻混匀于2-8°C避光条件下孵育5分钟。
6. 立即用流式细胞仪或荧光显微镜检测。
流式细胞仪分析：
上机检测前，须用待测细胞制备三个质控样本来设定流式细胞仪的荧光补偿和设置十字门的范围：
① 空白管，没有染色的细胞：不加Annexin V- Cy5。用于调节电压。
② 单染管，Annexin V- Cy5单染细胞：用明显凋亡的细胞，仅用Annexin V- Cy5染色细胞。用于调节补偿。
③ 单染管，7-AAD/PI/其它单染细胞：仅用核酸染料染色细胞。用于调节补偿。
④ 检测管：待测的处理细胞，加Annexin V- Cy5，加核酸染料。用空白管和单染管调节好电压补偿后，获得所需要的流式数据。
【注】：
具体流式设置按常规方法即可。请参照流式细胞仪说明书或咨询仪器技术支持。
经处理过的细胞此时可以在流式细胞仪上分析。
按照常规的流式凋亡检测的操作即可。
Annexin V-Cy5的荧光最大激发波长652nm，最大发射波长670nm；
荧光显微镜/激光共聚焦观察：
1. 滴加30-50ul用Annexin V-Cy5染色的细胞悬液于载玻片上，并用盖玻片盖上细胞。
注：对于贴壁细胞，可以象悬浮细胞那样染色后， 滴一滴细胞悬液于载玻片上，用盖玻片盖上细胞，荧光显微镜下观察。也可直接用盖玻片培养细胞并诱导细胞凋亡。根据盖玻片大小，置于24孔或12孔细胞培养板内培养，然后诱导细胞凋亡。细胞染色在细胞培养板内进行。先用PBS冲洗两次，加入400μl Annexin V结合液于孔中。再加入5μl Annexin V-Cy5染色液，混匀。避光室温反应10分钟。
2. 在荧光显微镜下用双色滤光片观察。
Annexin V-Cy5染色阳性的细胞将在细胞膜表面呈现明亮的红色。其它非渗透核酸染料在早期凋亡细胞不会被染色或显示背景荧光，而坏死或晚期凋亡细胞则会显示颜色，相应颜色的胞核和环绕细胞的红色胞膜。在晚期凋亡细胞中还可以观察到胞膜皱缩和起泡。
1. 离心收集悬浮细胞。离心机300-500g力，2-8°C，离心时间5分钟，弃培养基。（贴壁细胞用不含EDTA的胰酶消化后离心，收集细胞。胰酶消化时间不宜过长，以防损伤细胞膜，引起假阳性）。
2. 用冷PBS洗涤细胞两次。
3. 用400ul 1X Annexin V结合液悬浮细胞，浓度大约为1 X 106 cells/ml。
4. 在细胞悬浮液中加入5ul Annexin V- Cy5染色液，轻轻混匀后于2-8°C避光条件下孵育15分钟。
5. 加入其它颜色的核酸染色液后轻轻混匀于2-8°C避光条件下孵育5分钟。
6. 立即用流式细胞仪或荧光显微镜检测。
流式细胞仪分析：
上机检测前，须用待测细胞制备三个质控样本来设定流式细胞仪的荧光补偿和设置十字门的范围：
① 空白管，没有染色的细胞：不加Annexin V- Cy5。用于调节电压。
② 单染管，Annexin V- Cy5单染细胞：用明显凋亡的细胞，仅用Annexin V- Cy5染色细胞。用于调节补偿。
③ 单染管，7-AAD/PI/其它单染细胞：仅用核酸染料染色细胞。用于调节补偿。
④ 检测管：待测的处理细胞，加Annexin V- Cy5，加核酸染料。用空白管和单染管调节好电压补偿后，获得所需要的流式数据。
【注】：
具体流式设置按常规方法即可。请参照流式细胞仪说明书或咨询仪器技术支持。
经处理过的细胞此时可以在流式细胞仪上分析。
按照常规的流式凋亡检测的操作即可。
Annexin V-Cy5的荧光最大激发波长652nm，最大发射波长670nm；
荧光显微镜/激光共聚焦观察：
1. 滴加30-50ul用Annexin V-Cy5染色的细胞悬液于载玻片上，并用盖玻片盖上细胞。
注：对于贴壁细胞，可以象悬浮细胞那样染色后， 滴一滴细胞悬液于载玻片上，用盖玻片盖上细胞，荧光显微镜下观察。也可直接用盖玻片培养细胞并诱导细胞凋亡。根据盖玻片大小，置于24孔或12孔细胞培养板内培养，然后诱导细胞凋亡。细胞染色在细胞培养板内进行。先用PBS冲洗两次，加入400μl Annexin V结合液于孔中。再加入5μl Annexin V-Cy5染色液，混匀。避光室温反应10分钟。
2. 在荧光显微镜下用双色滤光片观察。
Annexin V-Cy5染色阳性的细胞将在细胞膜表面呈现明亮的红色。其它非渗透核酸染料在早期凋亡细胞不会被染色或显示背景荧光，而坏死或晚期凋亡细胞则会显示颜色，相应颜色的胞核和环绕细胞的红色胞膜。在晚期凋亡细胞中还可以观察到胞膜皱缩和起泡。
常见问题分析
实验过程中Annexin V染不上色或阳性率偏低。可能的原因如下：
1. 用于检测的流式细胞仪/显微镜设置不当。调整使用正确的仪器设置。
2. 确定实验中的诱导剂是否能产生凋亡。可通过设定确切凋亡诱导效果的阳性药物对照来排除这一情况。
3. 细胞未启动凋亡。重新确定诱导后凋亡启动的时间点（时程实验）。
4. 细胞数量偏少。增加细胞数量。
5. 贴壁细胞消化不当。Annexin V 跟PS 的结合需要Ca2+离子，结合液中含有Ca2+，EDTA 的消化会影响染色，建议使用无EDTA 的胰酶，或者消化后用PBS洗涤干净。
实验过程中阳性率偏高。可能的原因如下：
1. 用于检测的流式细胞仪/显微镜设置不当。调整使用正确的仪器设置。
2. 细胞本身活力太差。实验中发现未经诱导凋亡的对照细胞经染色后AnnexinV+/PI+双阳性的细胞比例过高，造成这种结果的原因可能是细胞本身活力太差。建议用台盼蓝染色计算细胞的活力，台盼蓝拒染的细胞应大于95%。若活力偏低低，建议重新复苏细胞，通常刚复苏的细胞至少要传代3 次以后才能进行实验。
1. 用于检测的流式细胞仪/显微镜设置不当。调整使用正确的仪器设置。
2. 确定实验中的诱导剂是否能产生凋亡。可通过设定确切凋亡诱导效果的阳性药物对照来排除这一情况。
3. 细胞未启动凋亡。重新确定诱导后凋亡启动的时间点（时程实验）。
4. 细胞数量偏少。增加细胞数量。
5. 贴壁细胞消化不当。Annexin V 跟PS 的结合需要Ca2+离子，结合液中含有Ca2+，EDTA 的消化会影响染色，建议使用无EDTA 的胰酶，或者消化后用PBS洗涤干净。
实验过程中阳性率偏高。可能的原因如下：
1. 用于检测的流式细胞仪/显微镜设置不当。调整使用正确的仪器设置。
2. 细胞本身活力太差。实验中发现未经诱导凋亡的对照细胞经染色后AnnexinV+/PI+双阳性的细胞比例过高，造成这种结果的原因可能是细胞本身活力太差。建议用台盼蓝染色计算细胞的活力，台盼蓝拒染的细胞应大于95%。若活力偏低低，建议重新复苏细胞，通常刚复苏的细胞至少要传代3 次以后才能进行实验。
参考文献
1.Wei Bing, Hanjun Sun et al.
Programmed Bacteria Death Induced by Carbon Dots with Different Surface Charge
Small 2016 （IF=8.315）
2.Linchong Sun, Libing Song et al.
cMyc-mediated activation of serine biosynthesis pathway is critical for cancer progression under nutrient deprivation conditions
Cell Research 2015 （IF=14.812）
3. Jian Chen, Weijie Zhang et al.
Mn(II) mediated degradation of artemisinin based on Fe3O4@MnSiO3-FA nanospheres for cancer therapy in vivo
Nanoscale 2015 （IF=7.76）
4. Yuanxin Zhang, Zhiyao Hou et al.
DNA-Hybrid-Gated Photothermal Mesoporous Silica Nanoparticles for NIR-Responsive and Aptamer-Targeted Drug Delivery
ACS Appl. Mater. Interfaces 2015 （IF=7.145）
Programmed Bacteria Death Induced by Carbon Dots with Different Surface Charge
Small 2016 （IF=8.315）
2.Linchong Sun, Libing Song et al.
cMyc-mediated activation of serine biosynthesis pathway is critical for cancer progression under nutrient deprivation conditions
Cell Research 2015 （IF=14.812）
3. Jian Chen, Weijie Zhang et al.
Mn(II) mediated degradation of artemisinin based on Fe3O4@MnSiO3-FA nanospheres for cancer therapy in vivo
Nanoscale 2015 （IF=7.76）
4. Yuanxin Zhang, Zhiyao Hou et al.
DNA-Hybrid-Gated Photothermal Mesoporous Silica Nanoparticles for NIR-Responsive and Aptamer-Targeted Drug Delivery
ACS Appl. Mater. Interfaces 2015 （IF=7.145）
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