2-8℃

1.离心管中的过滤膜一旦润湿后应避免变干。如果在预清洗后不是立即使用，则让液体保留在滤膜上，直到使用。
2.试剂拆封后请尽快使用完！

一年

植物

1.使用方便，无需超速离心，省时省力；
2.纯度高，富集量大，应用范围广；
3.获取的Exosome结构和功能完整；
4.稳定性好，便于运输，便于保存。

根据需要使用

1.离心机 2.移液器 3.冰箱 4.冰盒

1.PBS缓冲液 2.纯水

1.离心管2.吸头3.一次性手套

1.不同样本的外泌体数量差异极大，请根据实际情况选择样品的量，根据下游应用和参考文献确定。条件允许的情况下采用尽可能多的样本。
2.已经分离好的外泌体样本如果需要进行电镜观察，只能冰上或4℃保存，存放时间不超过两天，注意不可冷冻保存，否则可能会影响电镜观察效果。

清洗外泌体纯化离心管C：
1. 用缓冲液或纯水进行预清洗。
2. 离心管中的过滤膜一旦润湿后应避免变干。如果在预清洗后不是立即使用，则让液体保留在滤膜上，直到使用前移除并稍微离心甩干。

样品处理：
1. 收集500 mg-1 g新鲜的待提取植物样品，根据不同样品进行剥皮、彻底清洗等处理，置2-8℃保存。
2. 在样品中加入1-2 ml试剂A，然后用匀浆机/匀浆器充分匀浆。
3. 将匀浆液1000×g离心15分钟。弃沉淀，收集上清。
4. 小心将上清移入另一干净离心管中。
5. 将样品在4℃条件下，3000×g离心30分钟。弃沉淀，收集上清。
6. 小心将上清移入另一干净离心管中。
7. 将样品在4℃条件下，12000×g离心60分钟。弃沉淀，收集上清。
8. 小心将上清移入另一干净离心管中。即得到待提取植物匀浆液（0）。


外泌体粗提：
1. 将待提取植物匀浆液（0）上清吸入离心管D中，套上液体收集管，在4℃，10000×g条件下离心5-10分钟。

2. 将液体收集管中的液体吸入另一干净离心管。在4℃，16000×g条件下离心20分钟。弃沉淀，收集上清。即为1-2 ml外泌体粗提液（I）。
3. 将外泌体粗提液（I）吸入另一干净离心管。在4℃，16000×g条件下离心20分钟。弃沉淀，收集上清。即为1-2 ml外泌体粗提液（II）。然后进行下列外泌体纯化步骤操作。

外泌体纯化：
1. 将外泌体纯化离心管C（大）内管插入所提供的一个配套离心管中。
2. 向内管中加入2 ml的外泌体粗提液（II）样本，并盖上盖子。
3. 将盖好盖子的外泌体纯化离心管放入离心转子中，用一个类似的离心管平衡。
4. 以4000-10000×g离心约10-30分钟。离心至大约剩余100 μl液体。
5. 在50-100 μl残余液体中加入1 ml外泌体提取液B。
6. 以4000-10000×g离心约10-30分钟。离心至大约剩余100 μl液体。
7. 离心结束后将整个离心管从离心机中取出，取出内管。
8. 为了回收纯化后的外泌体，用200 μl移液器插入纯化管的底部，吸出纯化后的约100 μl纯化外泌体悬液，即得到外泌体样品纯品。。
9. 用纯水或缓冲液洗涤离心管C的内管和收集管，继续纯化下一个样品。

外泌体纯化离心管C（大）清洗和保存：
1. 使用后用水冲洗干净；
2. 内管加入超纯水4 ml，4000×g离心5分钟；
3. 吸净内管中的水，加入4 ml 0.1M NaOH，4000×g离心20分钟；
4. 用0.1 M NaOH 浸泡24小时；
5. 用水冲洗干净；
6. 用无菌水浸泡2-8℃保存。
7. 外管用自来水洗净后，用超纯水冲洗干净，晾干。

1.准备做植物外泌体研究，初始样品量需要准备多少？
不同样本外泌体含量差异较大，根据文献选择起始样本量。有条件的情况下尽可能使用多一点样本量。

2.如何鉴定提取的外泌体？
通常使用透射电镜检测（形态）、粒径检测（大小）、外泌体标志蛋白Western blot检测等方法鉴定提取的外泌体。

3.进行外泌体WB鉴定时有什么内参蛋白可供选择？
没有，该检测属于定性检测。

4.蛋白浓度低？
很多样本外泌体量不够下游应用，在条件允许的情况请尽可能加大植物样本的上样量。
处理部分外泌体样本时可能没有裂解完全，导致蛋白浓度低。请选择高质量的蛋白裂解液或蛋白提取试剂盒。

5.外泌体纯化管内管膜会因为离心时间过长而变干么？
不会，因为内管有死体积，总会有溶液残留在内管中。死体积大约20 μl。

6.可以重复使用过滤管么？
可以重复使用。如果使用、清洗、保存得当，可以反复使用多次。但是超过8次重复使用后过滤膜有破损风险，注意使用过程中尽量避免尖锐物品戳到膜。离心力不要过大。

1.Ruiyu Liu, et al.
iTRAQ-based proteomics and in vitro experiments reveals essential roles of ACE and AP-N in the renin–angiotensin system-mediated congenital ureteropelvic junction obstruction
Experimental Cell Research 2020

2.Feng Tian, et al.
miR-210 in Exosomes Derived from Macrophages under High Glucose Promotes Mouse Diabetic Obesity Pathogenesis by Suppressing NDUFA4 Expression
Journal of Diabetes Research 2020