2-8℃

1.离心管中的过滤膜一旦润湿后应避免变干。如果在预清洗后不是立即使用，则让液体保留在滤膜上，直到使用。
2.试剂拆封后请尽快使用完！

一年

外泌体研究

血清/血浆

1.使用方便，无需超速离心，省时省力；
2.纯度高，富集量大，应用范围广；
3.获取的Exosome结构和功能完整；
4.稳定性好，便于运输，便于保存。

外泌体研究

1.离心机
2.移液器
3.冰箱
4.冰盒

PBS缓冲液 HBSS 纯水

1.离心管
2.吸头
3.一次性手套

1.以下以2 ml血清/血浆为例，实际操作时按血清样本和提取液用量体积比等比例调整使用即可。
2.不同血清/血浆样本外泌体数量差异极大，请根据实际情况选择血清/血浆样本的量，根据下游应用和参考文献确定。条件允许的情况下采用尽可能多的血清/血浆样本。
3.常规的血清/血浆样本最佳上样量为3-5 ml及以上，条件允许的情况下采用尽可能多的血清/血浆样本。
4.已经分离好的外泌体样本如果需要进行电镜观察，只能冰上或4℃保存，存放时间不超过两天，注意不可冷冻保存，否则可能会影响电镜观察效果。

清洗外泌体纯化离心管D（大）：
1. 用缓冲液或纯水进行预清洗。
2. 离心管中的过滤膜一旦润湿后应避免变干。如果在预清洗后不是立即使用，则让液体保留在滤膜上，直到使用。

外泌体提取：
1. 收集2 ml待提取的血清/血浆样品，置2-8℃保存。
2. 将样品在4℃条件下，3000×g离心15分钟。弃沉淀，收集上清。
3. 小心将上清移入另一干净离心管中。
4. 将样品在4℃条件下，10000×g离心20分钟。弃沉淀，收集上清。
5. 小心将上清移入另一干净离心管中。
6. 在2 ml血清/血浆样品中加入2 ml提取液A，盖紧离心管盖。
7. 轻轻上下颠倒混匀1分钟左右，使液体充分混匀。制备成4 ml待提取外泌体悬液（I）。然后进行下列外泌体纯化步骤操作。

外泌体纯化：
1. 将外泌体纯化离心管D（大）内管插入所提供的一个配套离心管中。
2. 向内管中加入过4 ml的待提取外泌体悬液（I）样本，并盖上盖子。
3. 将盖好盖子的外泌体纯化离心管放入离心转子中，用一个类似的离心管平衡。
4. 以4000×g离心约10-15分钟。离心至大约剩余50 μl-100 μl液体。
5. 在50-100 μl残余液体中加入2 ml外泌体提取液B。
6. 以4000×g离心约10-15分钟。离心至大约剩余50 μl-100 μl液体。
7. 离心结束后将整个离心管从离心机中取出，取出内管。
8. 为了回收纯化后的外泌体，用200 μl移液器插入纯化管的底部，吸出纯化后的50 μl -100 μl纯化外泌体悬液（II）。
9. 套上外泌体纯化离心管E（小）的液体收集管，将纯化外泌体悬液（II）吸入外泌体纯化离心管E（小）的离心管（内管）中，在4℃，11000-13000×g条件下离心10-15分钟。
10. 吸取外泌体纯化离心管E（小）的收集管中的液体，即得到外泌体样品纯品。
11. 用纯水或缓冲液洗涤两种大小的内管和收集管，继续纯化下一个样品。

外泌体纯化离心管（大）清洗和保存：
1. 使用后用水冲洗干净；
2. 内管加入超纯水4 ml，4000×g离心5分钟；
3. 吸净内管中的水，加入4 ml 0.1 M NaOH，4000×g离心20分钟；
4. 用0.1 M NaOH 浸泡24小时；
5. 用水冲洗干净；
6. 用无菌水浸泡2-8℃保存。
7. 外管用自来水洗净后，用超纯水冲洗干净，晾干。

1.采用血浆（plasma）还是血清(serum)来源的外泌体？
对于大多数涉及到Exosome RNA分离的研究，我们推荐使用血浆（plasma）。因为血清收集后在凝血过程中，血小板受到刺激会产生许多Exosome和其他形式的小泡，因此血清中获得的小泡始终比血浆中多，甚至超过50%的小泡来源于血小板。所以血浆是研究病理生理状态下Exosome更好的介质。多数的criculating Exosome研究样本使用的是血浆。负压采血之后，血液首先存放入采血管，去除止血带，最初的几毫升不要，因为有压力激活效应，并且被成纤维细胞污染。血液收集应该轻柔并且迅速。颠倒混匀采血管8-10次，与管壁上的抗凝剂混合，但不要为了抗凝而剧烈摇动。离心前管子应该垂直存放，并记录实验室中存放的时间，因为从采血到离心除去细胞和血小板这中间的过程很重要，建议在30 min内完成，长时间的存放，而没有及时处理会导致血小板细胞Exosome的进一步释放。血液要尽快处理，在室温条件下分离血浆（或者血清）。所有样品要使用相同的转速和转子类型离心。

2.怎样选择抗凝剂？
抗凝剂有一个或多个形式的功能,包括螯合钙、蛋白酶抑制和抑制血小板活化。一般选用EDTA抗凝。其它有许多抗凝血剂可用，但不建议使用肝素（heparin）抗凝剂。无论是外源性或内源性起源（例如肥大细胞），肝素会抑制下游PCR反应，因为肝素会与引物和酶竞争与核酸结合。另外,肝素可抑制Exosome与靶细胞的结合,抑制Exosome激活血小板或降低血小板激活阈值。应用肝素治疗的病人也应该注意。 对于珍贵样本，可能需要从肝素化的血液样品中提取RNA。核酸的检测需要通过调整PCR的敏感性。另外如果Exosome相关核酸被发现只存在于Exosome内,在RNA分离之前的洗涤也可以帮助去除肝素。其它抗凝剂如EDTA、氟化钠/草酸钾(NaF/KOx),或柠檬酸三钠[加入/不加右旋糖dextrose(ACD)或茶碱(theophylline)、腺苷(adenosine)和双嘧达莫(CTAD)]就更复杂了，最好根据下游的试验来指导。CTAD阻碍血小板活化和随后的Exosome释放。EDTA可干扰PCR反应(尽管程度低于肝素),但它的存在可能是无害的。另外,下游实验的选择需要考虑到抗凝剂的使用种类。不同的聚合酶对抑制剂有不同的敏感性。

1.Yue Zhang, et al.
Cancer-associated fibroblasts-derived exosomal miR-17-5p promotes colorectal cancer aggressive phenotype by initiating a RUNX3/MYC/TGF-β1 positive feedback loop
Cancer Letters 2020