2-8℃

1.离心管中的过滤膜一旦润湿后应避免变干。如果在预清洗后不是立即使用，则让液体保留在滤膜上，直到使用。
2.试剂拆封后请尽快使用完！

一年

外泌体研究

细胞培养上清

1.使用方便，无需超速离心，省时省力；
2.纯度高，富集量大，应用范围广；
3.获取的Exosome结构和功能完整；
4.稳定性好，便于运输，便于保存。

外泌体研究

1.离心机（可以离心15ml圆锥形离心管）
2.移液器（200 μl）
3.冰箱
4.冰盒

PBS缓冲液 HBSS 纯水

1.离心管
2.吸头
3.一次性手套

1.以下以4ml细胞培养上清为例，实际操作时按细胞培养上清样本和提取液用量体积比等比例调整使用即可。
2.不同细胞分泌的外泌体数量差异极大，请根据实际情况选择培养基样品的量，根据下游应用和参考文献确定。条件允许的情况下采用尽可能多的细胞培养上清。
3.一般巨噬细胞、淋巴细胞、造血细胞、胰腺癌细胞等分泌外泌体较多，其它细胞样本建议每个样培养基上清用量不少于8ml。常规的细胞样本最佳培养上清上样量为15-20ml及以上，条件允许的情况下采用尽可能多的细胞培养上清。
4.条件允许的情况下可以将细胞培养上清浓缩后再提取外泌体。
5.在收获细胞时，应确定死亡细胞不超过5%。细胞凋亡/死亡过程中会释放大量大小不等的囊泡，它们在外泌体的提取过程中会污染活细胞产生的外泌体。
6.已经分离好的外泌体样本如果需要进行电镜观察，只能冰上或4℃保存，存放时间不超过两天，注意不可冷冻保存，否则可能会影响电镜观察效果。

清洗外泌体纯化离心管C（大）和D（小）：
1. 用缓冲液或纯水进行预清洗。
2. 离心管中的过滤膜一旦润湿后应避免变干。如果在预清洗后不是立即使用，则让液体保留在滤膜上，直到使用前移除并稍微离心甩干。

外泌体提取：
1. 收集4ml待提取的培养基样品，置2-8℃保存。
2. 将样品在4℃条件下，3000×g离心15分钟。弃沉淀，收集上清。
3. 小心将上清移入另一干净离心管中。
4. 将样品在4℃条件下，10000×g离心20分钟。弃沉淀，收集上清。
5. 小心将上清移入另一干净离心管中。即为4ml待提取细胞培养上清（I）。然后进行下列外泌体纯化步骤操作。

外泌体纯化：
1. 将外泌体纯化离心管C（大）内管插入所提供的一个配套离心管中。
2. 向内管中加入过4ml的待提取细胞培养上清（I）样本，并盖上盖子。
3. 将盖好盖子的外泌体纯化离心管放入离心转子中，用一个类似的离心管平衡。
4. 以4000×g离心约10-15分钟。离心至大约剩余50 μl-100 μl液体。
5. 在50-100 μl残余液体中加入2ml外泌体提取液A。
6. 以4000×g离心约10-15分钟。离心至大约剩余50 μl-100 μl液体。
7. 离心结束后将整个离心管从离心机中取出，取出内管。
8. 为了回收纯化后的外泌体，用200 μl移液器插入纯化管的底部，吸出纯化后的50-100 μl纯化外泌体悬液（II）。
9. 套上外泌体纯化离心管D（小）的液体收集管，将纯化外泌体悬液（II）吸入外泌体纯化离心管D（小）的离心管（内管）中，加入50 μl外泌体提取液B，在4℃，11000-13000×g条件下离心10-15分钟。
10. 吸取外泌体纯化离心管D（小）的收集管中的液体，即得到外泌体样品纯品。
11. 用纯水或缓冲液洗涤两种大小的内管和收集管，继续纯化下一个样品。

外泌体纯化离心管C（大）清洗和保存：
1. 使用后用水冲洗干净；
2. 内管加入超纯水4ml，4000g离心5分钟；
3. 吸净内管中的水，加入4ml 0.1M NaOH，4000×g离心20分钟；
4. 用0.1M NaOH 浸泡24小时；
5. 用水冲洗干净；
6. 用无菌水浸泡2-8℃保存。
7. 外管用自来水洗净后，用超纯水冲洗干净，晾干。

1.培养细胞时，如何去除血清来源的外泌体？
多数情况下，细胞在体外培时养需要血清，而血清中一般都含有外泌体，为避免血清对细胞外泌体的污染，可采用以下3种方法：（1）选择商品化的无外泌体血清进行细胞培养；（2）选择无血清培养基进行细胞培养；（3）将细胞培养用的血清通过100000g 超速离心10小时以上以去除血清外泌体。

2.无外泌体血清培养基（或者无血清培养基）在什么时候使用？
细胞在正常含血清的培养基中培养一定的时间后，细胞融合度约为60%-70%时，移去原有含血清的培养基，换成新鲜的无外泌体血清培养基（或者无血清培养基），继续培养24-48h，细胞融合度达到80%-95%左右时收取上清,该上清液即可用于提取外泌体。

3.准备做细胞外泌体siRNA 的NGS 测序，初始样品量需要准备多少？
普通肿瘤细胞系建议使用40mL 以上的初始样品量。由于某些细胞（如悬浮细胞、干细胞、神经细胞等）中外泌体含量比较低，建议先将上清浓缩，准备40mL 以上的浓缩液再使用本试剂盒提取外泌体。

1.Ruiyu Liu, et al.
iTRAQ-based proteomics and in vitro experiments reveals essential roles of ACE and AP-N in the renin–angiotensin system-mediated congenital ureteropelvic junction obstruction
Experimental Cell Research 2020

2.Feng Tian, et al.
miR-210 in Exosomes Derived from Macrophages under High Glucose Promotes Mouse Diabetic Obesity Pathogenesis by Suppressing NDUFA4 Expression
Journal of Diabetes Research 2020