2-8℃

 离心管中的过滤膜一旦润湿后应避免变干。如果在预清洗后不是立即使用，则让液体保留在滤膜上，直到使用。 低温有沉淀析出的话可以在37℃短时间水浴溶解，摇匀后使用。 试剂拆封后请尽快使用完！

一年

体液

1.使用方便，无需超速离心，省时省力；
2.纯度高，富集量大，应用范围广；
3.获取的Exosome结构和功能完整；
4.稳定性好，便于运输，便于保存。

根据需要使用

1.离心机 2.移液器 3.冰箱 4.冰盒

1.PBS缓冲液 2.纯水

1.离心管2.吸头3.一次性手套

 预实验很重要。必须要做预实验，在正式实验之前取少量样本优化实验条件，并像正式样本一样认真进行，看实验结果是否可行，实验条件是否适合自己的样本。由于生物样本的多样性，不同样本的实验条件通常差异较大，同种细胞的不同模型下需要的实验条件也可能不同，为了避免浪费正式样本和试剂，一定要提前预实验优化实验条件。 可以根据自己实验需要加入其它蛋白酶抑制剂。 以下以4 ml体液为例，实际操作时按体液和提取液A用量体积比4：1使用即可。 不同体液中所含的外泌体数量差异极大，请根据实际情况选择体液样品的量，根据下游应用和参考文献确定。条件允许的情况下采用尽可能多的体液样本。 除非已经确认体液样本中含有较多外泌体或者体液样本较难获得，一般体液样本建议每个样体液用量不少于8ml。最好能上样量为15-20 ml及以上，条件允许的情况下采用尽可能多的体液样本。 某些特殊体液样本，如果比较粘稠，可以用PBS缓冲液或者生理盐水2倍稀释后再按照下列步骤提取。 条件允许的情况下可以将体液样本浓缩后再提取外泌体。 已经分离好的外泌体样本如果需要进行电镜观察，只能冰上或4℃保存，存放时间不超过两天，注意不可冷冻保存，否则可能会影响电镜观察效果。 本试剂盒提取得到的外泌体为多个外泌体的聚合物，进行外泌体粒径检测时可能会显示粒径偏大。如果要进行粒径检测或电镜拍照，需要进行充分分散后使用。稀释后用涡旋振荡器充分振荡分散。或者使用其它方法提取的试剂盒（相关产品：BB-3904）。

1. 收集4 ml待提取的培养基样品，置2-8℃保存。 2. 将样品在4℃条件下，3000×g离心15分钟。弃沉淀，收集上清。 3. 小心将上清移入另一干净离心管中。 4. 将样品在4℃条件下，10000×g离心20分钟。弃沉淀，收集上清。 5. 小心将上清移入另一干净离心管中。 6. 在4 ml上清中加入1ml提取液A，盖紧离心管盖，上下颠倒混匀1分钟左右，使液体充分混匀。 7. 置2-8℃冰箱静置过夜。 8. 在4℃条件下，10000×g离心60分钟。 9. 小心移除上清，收集沉淀。 10. 取500 μl外泌体保存液将沉淀重悬，用移液器轻轻吹打混匀，得到外泌体沉淀重悬液，进行下列外泌体纯化步骤操作。 清洗外泌体纯化离心管： 1. 用缓冲液或纯水进行预清洗。 2. 离心管中的过滤膜一旦润湿后应避免变干。如果在预清洗后不是立即使用，则让液体保留在滤膜上，直到使用。 外泌体纯化： 1. 将外泌体纯化离心管内管插入所提供的一个微量离心管中。 2. 向内管中加入过500 μl的外泌体沉淀重悬液样本，并盖上盖子。 3. 将盖好盖子的外泌体纯化离心管放入离心转子中，让盖子的连接带朝着转子的中央；用一个类似的离心管平衡。 4. 以5000-8000 ×g离心约10-15分钟。离心至大约剩余50 μl-100 μl液体。 5. 离心结束后将整个离心管从离心机中取出，取出内管。 6. 为了回收纯化后的外泌体，将内管倒过来插在另一个干净的微量离心管中。放在离心机中，让打开的盖子朝着转子的中央；用一个类似的离心管进行平衡。 7. 以1000 ×g离心2分钟，使纯化后的外泌体样本从纯化内管转移到收集管中。 8. 吸取收集管中的液体，即得到外泌体样品纯品。 9. 用纯水或缓冲液洗涤内管和收集管，继续纯化下一个样品。 如果使用过的离心管需要长期保存，可以按下列方法清洗和保存离心管内管。 外泌体纯化离心管清洗和保存： 1. 使用后用水冲洗干净； 2. 内管加入超纯水500 µl，5000×g离心5分钟； 3. 吸净内管中的水，加入500 µl 0.1M NaOH，5000×g离心20分钟； 4. 用0.1 M NaOH 浸泡24小时； 5. 用水冲洗干净； 6. 用无菌水浸泡2-8℃保存。 7. 外管用自来水洗净后，用超纯水冲洗干净，晾干。

1.如何鉴定提取的外泌体？ 通常使用透射电镜检测（形态）、粒径检测（大小）、外泌体标志蛋白Western blot检测等方法鉴定提取的外泌体。 2.外泌体WB标志蛋白用什么？ 在进行WB检测时，通常检测外泌体标志蛋白为CD63、CD9、CD81、TSG101 、ALIX、HSP70等。 3.进行外泌体WB鉴定时有什么内参蛋白可供选择？没有，该检测属于定性检测。 4.蛋白浓度低？ 很多细胞外泌体量不够下游应用，在条件允许的情况请尽可能加大培养上清的上样量。处理部分样本时可能没有裂解完全，导致蛋白浓度低。请选择高质量的蛋白裂解液或蛋白提取试剂盒。5.抽提得到的RNA浓度低？很多细胞外泌体量不够下游应用，在条件允许的情况请尽可能加大培养上清的上样量。 5.外泌体纯化管内管膜会因为离心时间过长而变干么？ 不会，因为内管有死体积，总会有溶液残留在内管中。死体积大约10-20μl。 6.可以重复使用过滤管么？ 可以重复使用。如果使用、清洗、保存得当，可以反复使用多次。但是超过8次重复使用后过滤膜有破损风险，注意使用过程中尽量避免尖锐物品戳到膜。离心力不要过大。 7.外泌体在纯化时出现了沉淀，如何改进？ 如果过滤过快或者过度浓缩都有可能引起沉淀。如果样品的外泌体浓度很高，建议降低最终的外泌体浓度，保留更多的液体。对于因过滤速度敏感而导致的沉淀，建议的改进方法是： 1）离心力降低30%-50%2）在过滤过程中取出过滤管，用枪头反复吹吸几次。 有时候用外泌体纯化离心管连水都离不下来，可能是什么原因？如果出现这种情况，可能时过滤膜的孔被堵住。请先用0.1M NaOH清洗再离心。最后用缓冲液或纯水再次清洗后甩干。清洗后的滤膜应立即使用，如暂时不用，请保持润湿状态，避免重新干燥。 说明书中推荐在室温下进行离心，考虑到外泌体的稳定性，是否可以在4℃进行离心？可以，但是低温可能会增加外泌体样品的粘性，导致流速减慢，建议可将离心时间延长。

 Yue Zhang et al. Cancer-associated fibroblasts-derived exosomal miR-17-5p promotes colorectal cancer aggressive phenotype by initiating a RUNX3/MYC/TGF-β1 positive feedback loopCancer Letters 2020  Ruiyu Liu et al. iTRAQ-based proteomics and in vitro experiments reveals essential roles of ACE and AP-N in the renin–angiotensin system-mediated congenital ureteropelvic junction obstructionExperimental Cell Research 2020  Feng Tian et al. miR-210 in Exosomes Derived from Macrophages under High Glucose Promotes Mouse Diabetic Obesity Pathogenesis by Suppressing NDUFA4 ExpressionJournal of Diabetes Research 2020