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贝博® BBexosomeOUT® 总外泌体（Exosomes）提取试剂盒（血清/血浆用）适用于从各种血清/血浆样品中提取总外泌体。不需要超速离心，仅需通过简单的常规离心即可从样本中获取大量结构完整的外泌体，具有快速简单，提取效率高的特点，可节省更多的实验时间和样本。提取的外泌体可根据实验目的用于后续的多种实验，应用范围广泛。 外泌体是活细胞分泌的来源于晚期核内体(也称为多囊泡体 )的膜性小囊泡，直径约为30-150nm，天然存在于血液、唾液、尿液和母乳等各种体液中，研究发现，Exosome内含有与细胞来源相关的蛋白质、mRNA和microRNA，并且exosome能够通过生物屏障，在细胞间传递功能性核酸分子，从而发挥各种生物学功能。 外泌体囊泡已经成为细胞间通讯的重要介质，参与原核生物和高等真核生物细胞之间的生物信号传递，以调节不同范围的生物过程。外泌体囊泡的病理生理作用开始在包括癌症、感染性疾病和神经变性疾病在内的疾病中得到充分认识，显现了外泌体作为疾病的早期诊断、治疗干预的潜在新靶点的巨大应用前景。此外，未修饰和工程化的外泌体囊泡可能在大分子药物递送中具有应用价值。 传统的血清/血浆中分离和提取exosome的主要方法是超速离心法，这种方法缺点是耗时耗力，往往需要30-70个小时，每次最多只能处理6个样品，需要大量的起始材料，而且产量不高。 贝博® 生物自主开发的外泌体快速提取试剂盒系列产品，可以通过简单离心快速高效获得高纯度外泌体颗粒。本试剂盒提取的外泌体完好无缺，能用于各种功能研究、蛋白分析及RNA分析等下游应用实验。 本试剂盒按每个样本处理1.5ml血清/血浆计，每个50T试剂盒大约可以用于提取75ml血清/血浆。如果需要处理大量的血清/血浆，将提取液按说明书标准操作的体积等比例调整即可。 贝博® BBexosomeOUT® 还可以提供一小时快速提取获得各种样本外泌体的快速提取试剂盒（相关产品：BB-39032）。 贝博® BBproExtra® 可以提供针对动物细胞、组织、植物、真菌、酵母、微生物、藻类、液体、土壤等各种不同样本的蛋白提取试剂盒。 贝博® BBproExtra® 可以提供针对细胞膜、核、胞质、线粒体、溶酶体、高尔基体、内质网、外泌体等细胞不同部位的蛋白提取试剂盒。
2.试剂拆封后请尽快使用完！
2.纯度高，富集量大，应用范围广；
3.获取的Exosome结构和功能完整；
4.稳定性好，便于运输，便于保存。
2.移液器
3.冰箱
4.冰盒
2.吸头
3.一次性手套
2.不同血清/血浆样本外泌体数量差异极大，请根据实际情况选择血清/血浆样本的量，根据下游应用和参考文献确定。条件允许的情况下采用尽可能多的血清/血浆样本。
3.常规的血清/血浆样本最佳培养上清上样量为5-10 ml及以上，条件允许的情况下采用尽可能多的血清/血浆样本。
4.已经分离好的外泌体样本如果需要进行电镜观察，只能冰上或4℃保存，存放时间不超过两天，注意不可冷冻保存，否则可能会影响电镜观察效果。
1. 收集2 ml待提取的血清/血浆样品，置2-8℃保存。
2. 将样品在4℃条件下，3000×g离心15分钟。弃沉淀，收集上清。
3. 小心将上清移入另一干净离心管中。
4. 将样品在4℃条件下，10000×g离心20分钟。弃沉淀，收集上清。
5. 小心将上清移入另一干净离心管中。
6. 在2 ml血清/血浆样品中加入2 ml提取液A，盖紧离心管盖，上下颠倒混匀1分钟左右，使液体充分混匀。
7. 在4 ml液体样品中加入1 ml提取液B，盖紧离心管盖，上下颠倒混匀1分钟左右，使液体充分混匀。
8. 置2-8℃冰箱静置过夜。
9. 在4℃条件下，10000×g离心60分钟。
10. 小心移除上清，收集沉淀。
11. 取500 μl外泌体保存液将沉淀重悬，用移液器轻轻吹打混匀，得到外泌体沉淀重悬液，进行下列外泌体纯化步骤操作。
清洗外泌体纯化离心管：
1. 用缓冲液或纯水进行预清洗。
2. 离心管中的过滤膜一旦润湿后应避免变干。如果在预清洗后不是立即使用，则让液体保留在滤膜上，直到使用。
外泌体纯化：
1. 将外泌体纯化离心管内管插入所提供的一个微量离心管中。
2. 向内管中加入过500 μl的外泌体沉淀重悬液样本，并盖上盖子。
3. 将盖好盖子的外泌体纯化离心管放入离心转子中，让盖子的连接带朝着转子的中央；用一个类似的离心管平衡。
4. 以5000-8000 ×g离心约10-15分钟。离心至大约剩余50 μl-100 μl液体。
5. 离心结束后将整个离心管从离心机中取出，取出内管。
6. 为了回收纯化后的外泌体，将内管倒过来插在另一个干净的微量离心管中。放在离心机中，让打开的盖子朝着转子的中央；用一个类似的离心管进行平衡。
7. 以1000 ×g离心2分钟，使纯化后的外泌体样本从纯化内管转移到收集管中。
8. 吸取收集管中的液体，即得到外泌体样品纯品。
9. 用纯水或缓冲液洗涤内管和收集管，继续纯化下一个样品。
外泌体纯化离心管清洗和保存：
1. 使用后用水冲洗干净；
2. 内管加入超纯水500 µl，5000×g离心5分钟；
3. 吸净内管中的水，加入500 µl 0.1 M NaOH，5000×g离心20分钟；
4. 用0.1M NaOH 浸泡24小时；
5. 用水冲洗干净；
6. 用无菌水浸泡2-8℃保存。
7. 外管用自来水洗净后，用超纯水冲洗干净，晾干。
对于大多数涉及到Exosome RNA分离的研究，我们推荐使用血浆（plasma）。因为血清收集后在凝血过程中，血小板受到刺激会产生许多Exosome和其他形式的小泡，因此血清中获得的小泡始终比血浆中多，甚至超过50%的小泡来源于血小板。所以血浆是研究病理生理状态下Exosome更好的介质。多数的criculating Exosome研究样本使用的是血浆。负压采血之后，血液首先存放入采血管，去除止血带，最初的几毫升不要，因为有压力激活效应，并且被成纤维细胞污染。血液收集应该轻柔并且迅速。颠倒混匀采血管8-10次，与管壁上的抗凝剂混合，但不要为了抗凝而剧烈摇动。离心前管子应该垂直存放，并记录实验室中存放的时间，因为从采血到离心除去细胞和血小板这中间的过程很重要，建议在30min内完成，长时间的存放，而没有及时处理会导致血小板细胞Exosome的进一步释放。血液要尽快处理，在室温条件下分离血浆（或者血清）。所有样品要使用相同的转速和转子类型离心。
2.怎样选择抗凝剂？
抗凝剂有一个或多个形式的功能,包括螯合钙、蛋白酶抑制和抑制血小板活化。一般选用EDTA抗凝。其它有许多抗凝血剂可用，但不建议使用肝素（heparin）抗凝剂。无论是外源性或内源性起源（例如肥大细胞），肝素会抑制下游PCR反应，因为肝素会与引物和酶竞争与核酸结合。另外,肝素可抑制Exosome与靶细胞的结合,抑制Exosome激活血小板或降低血小板激活阈值。应用肝素治疗的病人也应该注意。 对于珍贵样本，可能需要从肝素化的血液样品中提取RNA。核酸的检测需要通过调整PCR的敏感性。另外如果Exosome相关核酸被发现只存在于Exosome内,在RNA分离之前的洗涤也可以帮助去除肝素。其它抗凝剂如EDTA、氟化钠/草酸钾(NaF/KOx),或柠檬酸三钠[加入/不加右旋糖dextrose(ACD)或茶碱(theophylline)、腺苷(adenosine)和双嘧达莫(CTAD)]就更复杂了，最好根据下游的试验来指导。CTAD阻碍血小板活化和随后的Exosome释放。EDTA可干扰PCR反应(尽管程度低于肝素),但它的存在可能是无害的。另外,下游实验的选择需要考虑到抗凝剂的使用种类。不同的聚合酶对抑制剂有不同的敏感性。
Cancer-associated fibroblasts-derived exosomal miR-17-5p promotes colorectal cancer aggressive phenotype by initiating a RUNX3/MYC/TGF-β1 positive feedback loop
Cancer Letters 2020
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