2-8℃

1.离心管中的过滤膜一旦润湿后应避免变干。如果在预清洗后不是立即使用，则让液体保留在滤膜上，直到使用。
2.试剂拆封后请尽快使用完！

一年

外泌体研究

细胞培养上清

1.使用方便，无需超速离心，省时省力；
2.纯度高，富集量大，应用范围广；
3.获取的Exosome结构和功能完整；
4.稳定性好，便于运输，便于保存。

外泌体研究

1.离心机
2.移液器
3.冰箱
4.冰盒

PBS缓冲液 HBSS 纯水

1.离心管
2.吸头
3.一次性手套

1.可以根据自己实验需要加入其它蛋白酶抑制剂。
2.以下以4ml培养基为例，实际操作时按培养基和提取液A用量体积比4：1使用即可。
3.不同细胞分泌的外泌体数量差异极大，请根据实际情况选择培养基样品的量，根据下游应用和参考文献确定。条件允许的情况下采用尽可能多的细胞培养上清。
4.一般巨噬细胞、淋巴细胞、造血细胞、胰腺癌细胞等分泌外泌体较多，其它细胞样本建议每个样培养基上清用量不少于8ml。常规的细胞样本最佳培养上清上样量为15-20ml及以上，条件允许的情况下采用尽可能多的细胞培养上清。
5.条件允许的情况下可以将细胞培养上清浓缩后再提取外泌体。
6.在收获细胞时，应确定死亡细胞不超过5%。细胞凋亡/死亡过程中会释放大量大小不等的囊泡，它们在外泌体的提取过程中会污染活细胞产生的外泌体。
7.已经分离好的外泌体样本如果需要进行电镜观察，只能冰上或4℃保存，存放时间不超过两天，注意不可冷冻保存，否则可能会影响电镜观察效果。

外泌体提取：
1. 收集4ml待提取的培养基样品，置2-8℃保存。
2. 将样品在4℃条件下，3000g离心15分钟。弃沉淀，收集上清。
3. 小心将上清移入另一干净离心管中。
4. 将样品在4℃条件下，10000g离心20分钟。弃沉淀，收集上清。
5. 小心将上清移入另一干净离心管中。
6. 在4ml上清中加入1ml提取液A，盖紧离心管盖，上下颠倒混匀1分钟左右，使液体充分混匀。
7. 置2-8℃冰箱静置过夜。
8. 在4℃条件下，10000g离心60分钟。
9. 小心移除上清，收集沉淀。
10. 取500ul外泌体保存液将沉淀重悬，用移液器轻轻吹打混匀，得到外泌体沉淀重悬液，进行下列外泌体纯化步骤操作。

清洗外泌体纯化离心管：
1. 用缓冲液或纯水进行预清洗。
2. 离心管中的过滤膜一旦润湿后应避免变干。如果在预清洗后不是立即使用，则让液体保留在滤膜上，直到使用。

外泌体纯化：
1. 将外泌体纯化离心管内管插入所提供的一个微量离心管中。
2. 向内管中加入过500 ul的外泌体沉淀重悬液样本，并盖上盖子。
3. 将盖好盖子的外泌体纯化离心管放入离心转子中，让盖子的连接带朝着转子的中央；用一个类似的离心管平衡。
4. 以5000-8000 ×g离心约10-15分钟。离心至大约剩余50ul-100ul液体。
5. 离心结束后将整个离心管从离心机中取出，取出内管。
6. 为了回收纯化后的外泌体，将内管倒过来插在另一个干净的微量离心管中。放在离心机中，让打开的盖子朝着转子的中央；用一个类似的离心管进行平衡。
7. 以1000 x g离心2分钟，使纯化后的外泌体样本从纯化内管转移到收集管中。
8. 吸取收集管中的液体，即得到外泌体样品纯品。
9. 用纯水或缓冲液洗涤内管和收集管，继续纯化下一个样品。

外泌体纯化离心管清洗和保存：
1. 使用后用水冲洗干净；
2. 内管加入超纯水500µl，5000g离心5分钟；
3. 吸净内管中的水，加入500µl 0.1M NaOH，5000g离心20分钟；
4. 用0.1M NaOH 浸泡24小时；
5. 用水冲洗干净；
6. 用无菌水浸泡2-8℃保存。
7. 外管用自来水洗净后，用超纯水冲洗干净，晾干。

1.培养细胞时，如何去除血清来源的外泌体？
多数情况下，细胞在体外培时养需要血清，而血清中一般都含有外泌体，为避免血清对细胞外泌体的污染，可采用以下3种方法：（1）选择商品化的无外泌体血清进行细胞培养；（2）选择无血清培养基进行细胞培养；（3）将细胞培养用的血清通过100000g 超速离心10小时以上以去除血清外泌体。
2.无外泌体血清培养基（或者无血清培养基）在什么时候使用？
细胞在正常含血清的培养基中培养一定的时间后，细胞融合度约为60%-70%时，移去原有含血清的培养基，换成新鲜的无外泌体血清培养基（或者无血清培养基），继续培养24-48h，细胞融合度达到80%-95%左右时收取上清,该上清液即可用于提取外泌体。
3.准备做细胞外泌体siRNA 的NGS 测序，初始样品量需要准备多少？
普通肿瘤细胞系建议使用40mL 以上的初始样品量。由于某些细胞（如悬浮细胞、干细胞、神经细胞等）中外泌体含量比较低，建议先将上清浓缩，准备40mL 以上的浓缩液再使用本试剂盒提取外泌体。
4.如何鉴定提取的外泌体？
通常使用透射电镜检测（形态）、粒径检测（大小）、外泌体标志蛋白Western blot检测等方法鉴定提取的外泌体。