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产品概述
product description
内质网存在于除哺乳动物成熟的红细胞外的各种真核细胞中。内质网为由生物膜构成的互相通连的片层隙状或小管状系统，膜片间的隙状空间称为池，通常与细胞外隙和细胞浆基质之间不直接相通。这种细胞内的膜性管道系统一方面构成细胞内物质运输的通路，另方面为细胞内各种各样的酶反应提供广阔的反应面积。内质网的功能与蛋白质的合成、糖类和脂类的合成、解毒、同化作用有关，并且还具有运输蛋白质的功能。
贝博® BBproExtra® 酵母内质网膜蛋白提取试剂盒提供全套试剂，适用于从各种酵母样品中提取内质网膜蛋白。提取过程简单方便。
本试剂盒不能用于冻存样品的内质网膜蛋白提取。
本产品的蛋白酶抑制剂混合物中不含AEBSF，可以避免由于AEBSF导致的质谱峰漂移，因此使用本产品提取的蛋白样品可以用于质谱(Mass Spectrometry, MS)检测和分析，蛋白质组学(proteomics)等相关研究。
本试剂盒提取的蛋白为具有天然蛋白构象的活性蛋白。
本试剂盒中不含有EDTA，与金属螯和层析等下游应用兼容。
本试剂盒提取的蛋白也可用于Western Blotting、蛋白质电泳、免疫沉淀、ELISA、转录活性分析、Gel shift凝胶阻滞实验、酶活性测定等下游蛋白研究实验。
保存温度
2-8℃
注意事项
1. 酵母洗涤液长期不用时-20℃保存。
2. 蛋白酶抑制剂未开盖使用前也可以2-8℃储存。开盖使用后-20℃储存。
3. 试剂拆封后请尽快使用完！
2. 蛋白酶抑制剂未开盖使用前也可以2-8℃储存。开盖使用后-20℃储存。
3. 试剂拆封后请尽快使用完！
有效期
一年
检测方法
蛋白质组学
适用样本
酵母
仪器准备
1. 离心机
2. 振荡器
3. 涡旋混匀器
4. 移液器
5. 冰箱
6. 冰盒
2. 振荡器
3. 涡旋混匀器
4. 移液器
5. 冰箱
6. 冰盒
试剂准备
1. PBS缓冲液
2. 蛋白定量试剂盒
2. 蛋白定量试剂盒
耗材准备
3. 离心管
4. 吸头
5. 一次性手套
4. 吸头
5. 一次性手套
使用注意事项
1. 预实验很重要。必须要做预实验，在正式实验之前取少量样本优化实验条件，并像正式样本一样认真进行，看实验结果是否可行，实验条件是否适合自己的样本。由于生物样本的多样性，不同样本的实验条件通常差异较大，同种细胞的不同模型下需要的实验条件也可能不同，为了避免浪费正式样本和试剂，一定要提前预实验优化实验条件。
2. 旋帽离心管装的试剂在开盖前请短暂离心，将盖内壁上的液体甩至管底，避免开盖时液体洒落。
3. 实验过程中的所有试剂须预冷；所有器具须放-20℃冰箱预冷。整个过程须保持样品处于低温。
4. 要求离心力50000×g的离心，没有条件的话可以采用30000×g -50000×g离心力，最好能达到45000×g左右。最小离心力需要保证30000×g。
5. 蛋白酶抑制剂储存期间溶液如果出现沉淀，不影响使用，溶解后正常使用。
6. 蛋白酶抑制剂在2-8℃低温时是固体状态，从冰箱取出后恢复至室温或37℃短时间水浴，变成液体状态后离心至管底部再开盖。
7. 可以根据自己实验需要加入其它蛋白酶抑制剂单品。
8. 提取液E在使用前须一直置于2-8℃条件，否则下游膜蛋白提取时会导致不容易分层。
9. 膜蛋白电泳时loading buffer应该避免煮沸。
10. 膜蛋白电泳时可以提高loading buffer的SDS含量。
11. 离心机转速有相对离心力（RCF，×g）和每分钟转速（RPM）两种表示方式，有些离心机设置有RPM和×g显示切换，但部分离心机没有自动切换功能。需要用下面的公式进行换算：g=r×1.118×10-5×rpm2 （r 为有效离心半径，即从离心机轴心到离心收集管底部中心位置的长度，单位为厘米) 例如: 转速为3000 rpm，有效离心半径为10 cm，则相对离心力（RCF，×g）为=10×1.118×10-5×30002=1006.2（×g）。
2. 旋帽离心管装的试剂在开盖前请短暂离心，将盖内壁上的液体甩至管底，避免开盖时液体洒落。
3. 实验过程中的所有试剂须预冷；所有器具须放-20℃冰箱预冷。整个过程须保持样品处于低温。
4. 要求离心力50000×g的离心，没有条件的话可以采用30000×g -50000×g离心力，最好能达到45000×g左右。最小离心力需要保证30000×g。
5. 蛋白酶抑制剂储存期间溶液如果出现沉淀，不影响使用，溶解后正常使用。
6. 蛋白酶抑制剂在2-8℃低温时是固体状态，从冰箱取出后恢复至室温或37℃短时间水浴，变成液体状态后离心至管底部再开盖。
7. 可以根据自己实验需要加入其它蛋白酶抑制剂单品。
8. 提取液E在使用前须一直置于2-8℃条件，否则下游膜蛋白提取时会导致不容易分层。
9. 膜蛋白电泳时loading buffer应该避免煮沸。
10. 膜蛋白电泳时可以提高loading buffer的SDS含量。
11. 离心机转速有相对离心力（RCF，×g）和每分钟转速（RPM）两种表示方式，有些离心机设置有RPM和×g显示切换，但部分离心机没有自动切换功能。需要用下面的公式进行换算：g=r×1.118×10-5×rpm2 （r 为有效离心半径，即从离心机轴心到离心收集管底部中心位置的长度，单位为厘米) 例如: 转速为3000 rpm，有效离心半径为10 cm，则相对离心力（RCF，×g）为=10×1.118×10-5×30002=1006.2（×g）。
使用方法
1. 提取液准备：
每500 μl冷的蛋白提取液E中加入2 μl蛋白酶抑制剂混合物，混匀后置冰上备用。
2. 酵母培养物，在4℃，1000×g条件下离心5-10分钟，小心吸取培养基，尽可能吸干，收集酵母沉淀。
3. 用PBS洗涤酵母两次，每次洗涤后尽可能吸干上清。
4. 每100 μl体积或100 mg湿重酵母沉淀物中加入400 μl酵母内质网提取液A，混匀后，在30℃条件下保温15分钟。
5. 在1000×g条件下离心5-10分钟，收集酵母沉淀。
6. 用300 μl酵母洗涤液D洗涤酵母一次，离心收集酵母。
7. 酵母沉淀物中加入500 μl酵母内质网提取液B，充分混匀后。
8. 在37℃或室温条件下轻微振荡60-90分钟。
9. 在2000×g条件下离心5-10分钟，弃上清，收集沉淀。
10. 沉淀用300 μl酵母洗涤液D洗涤两次。离心收集沉淀。
11. 在沉淀中加入400 μl酵母内质网提取液 C，充分混匀，然后在振荡器上振荡15-30分钟。
12. 在4℃，500×g条件下离心5分钟，弃沉淀，收集上清。
13. 将上清吸入另一干净离心管。
14. 在4℃，11000×g条件下离心20分钟。弃沉淀，收集上清。
15. 将上清在4℃，50000×g力条件下离心45分钟。弃上清，收集沉淀。
16. 在沉淀中加入200-300 μl冷的内质网膜蛋白提取液E，充分混匀。
17. 在2-8℃条件下振荡20-30分钟。
18. 在37℃水浴/气浴5-10分钟。
19. 在37℃，6000×g力离心5分钟，此时溶液分为两层，下层是ER膜蛋白约为30-40μl。
20. 小心移除上层液体，保留下层。
21. 用50-100 μl冷的试剂F膜蛋白溶解液溶解下层膜蛋白部分，即得内质网膜蛋白。
22. 将上述蛋白提取物定量后分装于-80℃冰箱保存备用或直接用于下游实验。
23. 将蛋白样品透析处理或者脱盐柱脱盐处理后用于下游实验。
每500 μl冷的蛋白提取液E中加入2 μl蛋白酶抑制剂混合物，混匀后置冰上备用。
2. 酵母培养物，在4℃，1000×g条件下离心5-10分钟，小心吸取培养基，尽可能吸干，收集酵母沉淀。
3. 用PBS洗涤酵母两次，每次洗涤后尽可能吸干上清。
4. 每100 μl体积或100 mg湿重酵母沉淀物中加入400 μl酵母内质网提取液A，混匀后，在30℃条件下保温15分钟。
5. 在1000×g条件下离心5-10分钟，收集酵母沉淀。
6. 用300 μl酵母洗涤液D洗涤酵母一次，离心收集酵母。
7. 酵母沉淀物中加入500 μl酵母内质网提取液B，充分混匀后。
8. 在37℃或室温条件下轻微振荡60-90分钟。
9. 在2000×g条件下离心5-10分钟，弃上清，收集沉淀。
10. 沉淀用300 μl酵母洗涤液D洗涤两次。离心收集沉淀。
11. 在沉淀中加入400 μl酵母内质网提取液 C，充分混匀，然后在振荡器上振荡15-30分钟。
12. 在4℃，500×g条件下离心5分钟，弃沉淀，收集上清。
13. 将上清吸入另一干净离心管。
14. 在4℃，11000×g条件下离心20分钟。弃沉淀，收集上清。
15. 将上清在4℃，50000×g力条件下离心45分钟。弃上清，收集沉淀。
16. 在沉淀中加入200-300 μl冷的内质网膜蛋白提取液E，充分混匀。
17. 在2-8℃条件下振荡20-30分钟。
18. 在37℃水浴/气浴5-10分钟。
19. 在37℃，6000×g力离心5分钟，此时溶液分为两层，下层是ER膜蛋白约为30-40μl。
20. 小心移除上层液体，保留下层。
21. 用50-100 μl冷的试剂F膜蛋白溶解液溶解下层膜蛋白部分，即得内质网膜蛋白。
22. 将上述蛋白提取物定量后分装于-80℃冰箱保存备用或直接用于下游实验。
23. 将蛋白样品透析处理或者脱盐柱脱盐处理后用于下游实验。
常见问题分析
1. 蛋白浓度低？
膜蛋白丰度比较低，在条件允许的情况下，需要尽可能加大细胞的上样量以提高膜蛋白浓度。
处理部分样本时可能没有裂解完全，导致蛋白浓度低。只要适当延长试剂AE的处理时间即可。最好在持续振荡的条件下处理，没有振荡器也可间隔几分钟用吸头吹打混匀。
2. 用什么方法定量蛋白？
建议用BCA法。不适合用Bradford法，因为试剂A中含有干扰Bradford法的组份，导致定量不准。如果已经进行过透析处理或者用脱盐柱改换过缓冲体系，则可以用Bradford法定量。
3. 提取的蛋白具有活性吗？
本试剂盒不含有离子型去垢剂组份，不破坏蛋白的结构，没有对蛋白质之间原有的相互作用的破坏，蛋白均保持其天然构象和活性。
4. 膜蛋白电泳没有条带？
膜蛋白样品通常浓度较低，电泳前一定要进行蛋白定量，以保证电泳是蛋白上样量足够。
膜蛋白提取好后，用溶解液充分溶解后，可以超声处理一下，再进行蛋白定量。
蛋白加Loading buffer后可以不用煮沸，采用50℃保温30分钟。
蛋白Loading buffer中SDS终浓度含量可以提高至3%-10%。
有些样品的膜蛋白含量太低，可以使用丙酮沉淀膜蛋白，再使膜蛋白溶解于上样缓冲液中，一般可以跑出清晰的蛋白条带。
电泳时最好采用低电压低电流电泳。
膜蛋白丰度通常较低，有条件可以尝试用银染染色。
膜蛋白丰度比较低，在条件允许的情况下，需要尽可能加大细胞的上样量以提高膜蛋白浓度。
处理部分样本时可能没有裂解完全，导致蛋白浓度低。只要适当延长试剂AE的处理时间即可。最好在持续振荡的条件下处理，没有振荡器也可间隔几分钟用吸头吹打混匀。
2. 用什么方法定量蛋白？
建议用BCA法。不适合用Bradford法，因为试剂A中含有干扰Bradford法的组份，导致定量不准。如果已经进行过透析处理或者用脱盐柱改换过缓冲体系，则可以用Bradford法定量。
3. 提取的蛋白具有活性吗？
本试剂盒不含有离子型去垢剂组份，不破坏蛋白的结构，没有对蛋白质之间原有的相互作用的破坏，蛋白均保持其天然构象和活性。
4. 膜蛋白电泳没有条带？
膜蛋白样品通常浓度较低，电泳前一定要进行蛋白定量，以保证电泳是蛋白上样量足够。
膜蛋白提取好后，用溶解液充分溶解后，可以超声处理一下，再进行蛋白定量。
蛋白加Loading buffer后可以不用煮沸，采用50℃保温30分钟。
蛋白Loading buffer中SDS终浓度含量可以提高至3%-10%。
有些样品的膜蛋白含量太低，可以使用丙酮沉淀膜蛋白，再使膜蛋白溶解于上样缓冲液中，一般可以跑出清晰的蛋白条带。
电泳时最好采用低电压低电流电泳。
膜蛋白丰度通常较低，有条件可以尝试用银染染色。
参考文献
1. Yingchao Xu et al.
Cellular mechanism for the improvement of multiple stress tolerance in brewer's yeast by potassium ion supplementation
International Journal of Food Science & Technology 2019
2. Yang Zhang et al.
A Peptide from Budding Yeast GAPDH Serves as a Promising Antifungal against Cryptococcus neoformans
Microbiology Spectrum 2022
3. RuhanJiang et al.
A study on the degradation efficiency of fluoranthene and the transmembrane protein mechanism of Rhodococcus sp. BAP-1 based on iTRAQ
Science of The Total Environment 2020
Cellular mechanism for the improvement of multiple stress tolerance in brewer's yeast by potassium ion supplementation
International Journal of Food Science & Technology 2019
2. Yang Zhang et al.
A Peptide from Budding Yeast GAPDH Serves as a Promising Antifungal against Cryptococcus neoformans
Microbiology Spectrum 2022
3. RuhanJiang et al.
A study on the degradation efficiency of fluoranthene and the transmembrane protein mechanism of Rhodococcus sp. BAP-1 based on iTRAQ
Science of The Total Environment 2020
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