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产品概述
product description
线粒体(mitochondria)是真核细胞中产生能量的重要细胞器。细胞中的能源物质—脂肪、糖、部分氨基酸在此进行最终的氧化，并通过偶联磷酸化生成ATP，供给细胞生理活动之需。对线粒体结构与功能的研究通常是在离体的线粒体上进行的。 贝博TM BBproExtraTM酵母线粒体膜蛋白提取试剂盒提供全套试剂，适用于从各种酵母样品中提取线粒体膜蛋白。提取过程简单方便。 本试剂盒含有的独特配方能够有效溶解线粒体膜组份。本试剂盒含有的蛋白酶抑制剂混合物，阻止了蛋白酶对蛋白的降解，为提取高纯度的蛋白提供了保证。 本试剂盒中不含有EDTA，与金属螯和层析等下游应用兼容。 本试剂盒不能用于冷冻样品的线粒体膜蛋白提取。 本试剂盒提取的蛋白样本不含有盐成分，可直接用于等电聚焦、2D电泳，如需要用于Western Blotting、蛋白质电泳、免疫沉淀、ELISA、转录活性分析、Gel shift凝胶阻滞实验、酶活性测定等下游蛋白研究实验，请使用贝博其他货号的试剂盒。（相关产品BB-31582）。
保存温度
2-8℃
注意事项
1.蛋白酶抑制剂未开盖使用前也可以2-8℃储存。开盖使用后-20℃储存。
2.蛋白酶抑制剂在2-8℃低温时是固体状态，从冰箱取出后恢复至室温或37℃短时间水浴，变成液体状态后离心至管底部再开盖。
3.试剂拆封后请尽快使用完！
2.蛋白酶抑制剂在2-8℃低温时是固体状态，从冰箱取出后恢复至室温或37℃短时间水浴，变成液体状态后离心至管底部再开盖。
3.试剂拆封后请尽快使用完！
有效期
一年
检测方法
双向电泳
适用样本
酵母
产品特点
1、 使用方便。
2、 含蛋白稳定剂，提取的蛋白稳定。
3、 紫外检测蛋白浓度时，背景干扰低。
4、 蛋白酶抑制剂抑制了蛋白的降解，蛋白酶抑制剂配方优化。蛋白酶抑制剂混合物包含6种独立的蛋白酶抑制剂；每一种抑制剂可特异性抑制某一种或几种蛋白酶活性。该混合物优化的组成使其可以抑制几乎所有重要的蛋白酶活性，包括丝氨酸蛋白酶、半胱氨酸酸蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶、丙氨酰-氨基肽酶等。
2、 含蛋白稳定剂，提取的蛋白稳定。
3、 紫外检测蛋白浓度时，背景干扰低。
4、 蛋白酶抑制剂抑制了蛋白的降解，蛋白酶抑制剂配方优化。蛋白酶抑制剂混合物包含6种独立的蛋白酶抑制剂；每一种抑制剂可特异性抑制某一种或几种蛋白酶活性。该混合物优化的组成使其可以抑制几乎所有重要的蛋白酶活性，包括丝氨酸蛋白酶、半胱氨酸酸蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶、丙氨酰-氨基肽酶等。
产品应用
双向电泳
仪器准备
1.离心机
2.振荡器
3.涡旋混匀器
4.移液器
5.冰箱
6.冰盒
2.振荡器
3.涡旋混匀器
4.移液器
5.冰箱
6.冰盒
试剂准备
1.PBS缓冲液
2.蛋白定量试剂盒
2.蛋白定量试剂盒
耗材准备
1.离心管
2.吸头
3.一次性手套
2.吸头
3.一次性手套
使用注意事项
使用注意事项：
旋帽离心管装的试剂在开盖前请短暂离心，将盖内壁上的液体甩至管底，避免开盖时液体洒落。
蛋白酶抑制剂在2-8℃时是固体状态，从冰箱取出后恢复至室温或37℃短时间水浴，变成液体状态后离心至管底部再开盖。
实验过程中的所有试剂须预冷；所有器具须放-20℃冰箱预冷。整个过程须保持样品处于低温。
蛋白酶抑制剂储存期间溶液如果出现沉淀，不影响使用，溶解后正常使用。
如果试剂盒不能短时间内用完，蛋白酶抑制剂混合物不可以一次全部加入提取液。
可以根据自己实验需要加入其它蛋白酶抑制剂单品。
旋帽离心管装的试剂在开盖前请短暂离心，将盖内壁上的液体甩至管底，避免开盖时液体洒落。
蛋白酶抑制剂在2-8℃时是固体状态，从冰箱取出后恢复至室温或37℃短时间水浴，变成液体状态后离心至管底部再开盖。
实验过程中的所有试剂须预冷；所有器具须放-20℃冰箱预冷。整个过程须保持样品处于低温。
蛋白酶抑制剂储存期间溶液如果出现沉淀，不影响使用，溶解后正常使用。
如果试剂盒不能短时间内用完，蛋白酶抑制剂混合物不可以一次全部加入提取液。
可以根据自己实验需要加入其它蛋白酶抑制剂单品。
使用方法
1. 酵母培养物，在4℃，5000g条件下离心5-10分钟，小心吸取培养基，尽可能吸干，收集酵母沉淀。
2. 用PBS洗涤酵母两次，每次洗涤后尽可能吸干上清。
3. 每100ul体积酵母沉淀物中加入400ul酵母线粒体提取液A，混匀后，在30℃条件下保温15分钟。
4. 5000g条件下离心5-10分钟，收集酵母沉淀。
5. 用PBS洗涤酵母一次，离心收集菌体。
6. 酵母沉淀物中加入500ul酵母线粒体提取液B，混匀后，在37℃或室温条件下轻微振荡45-120分钟。
7. 在5000g条件下离心5-10分钟，收集沉淀，弃上清。
8. 沉淀用PBS洗涤两次。离心收集沉淀。
9. 沉淀中加入500μl酵母线粒体提取液 C，充分混匀，然后在振荡器上轻轻振荡20-40分钟。
10. 高速涡旋振荡5秒，然后在4℃，500g条件下离心3分钟。
11. 将上清吸入另一干净离心管，收集上清，弃沉淀。
12. 在4℃，11000g条件下离心20分钟。
13. 弃上清，在沉淀中加入200-400μl冷的线粒体膜蛋白提取液D，混匀。
14. 在4℃条件下轻轻振荡20-30分钟。
15. 在4℃，12000×g条件下离心5分钟。
16. 将上清吸入另一干净离心管，37℃水浴5-10分钟，37℃下1000g-2000g力离心5分钟，此时溶液分为两层（对着光线看），下层是膜蛋白约为20-50μl。
17. 小心移除上层，留下下层即为线粒体膜蛋白。
18. 用50-100ul膜蛋白溶解液E溶解下层，即得到酵母线粒体膜蛋白样品。
19. 将上述蛋白提取物定量后分装于-80℃冰箱保存备用或直接用于下游实验。
2. 用PBS洗涤酵母两次，每次洗涤后尽可能吸干上清。
3. 每100ul体积酵母沉淀物中加入400ul酵母线粒体提取液A，混匀后，在30℃条件下保温15分钟。
4. 5000g条件下离心5-10分钟，收集酵母沉淀。
5. 用PBS洗涤酵母一次，离心收集菌体。
6. 酵母沉淀物中加入500ul酵母线粒体提取液B，混匀后，在37℃或室温条件下轻微振荡45-120分钟。
7. 在5000g条件下离心5-10分钟，收集沉淀，弃上清。
8. 沉淀用PBS洗涤两次。离心收集沉淀。
9. 沉淀中加入500μl酵母线粒体提取液 C，充分混匀，然后在振荡器上轻轻振荡20-40分钟。
10. 高速涡旋振荡5秒，然后在4℃，500g条件下离心3分钟。
11. 将上清吸入另一干净离心管，收集上清，弃沉淀。
12. 在4℃，11000g条件下离心20分钟。
13. 弃上清，在沉淀中加入200-400μl冷的线粒体膜蛋白提取液D，混匀。
14. 在4℃条件下轻轻振荡20-30分钟。
15. 在4℃，12000×g条件下离心5分钟。
16. 将上清吸入另一干净离心管，37℃水浴5-10分钟，37℃下1000g-2000g力离心5分钟，此时溶液分为两层（对着光线看），下层是膜蛋白约为20-50μl。
17. 小心移除上层，留下下层即为线粒体膜蛋白。
18. 用50-100ul膜蛋白溶解液E溶解下层，即得到酵母线粒体膜蛋白样品。
19. 将上述蛋白提取物定量后分装于-80℃冰箱保存备用或直接用于下游实验。
常见问题分析
1.蛋白浓度低？
酵母线粒体膜蛋白丰度极低，在条件允许的情况下，需要尽可能加大酵母细胞的上样量。
处理部分组织样本时可能没有裂解完全，导致蛋白浓度低。只要适当延长试剂BCD的处理时间即可。最好在持续振荡的条件下处理，没有振荡器也可间隔几分钟用吸头吹打混匀。
2.用什么方法定量蛋白？
建议用BCA法。不适合用Bradford法，因为试剂E中含有干扰Bradford法的组份，导致定量不准。如果已经进行过透析处理或者用脱盐柱改换过缓冲体系，则可以用Bradford法定量。
3.提取的蛋白具有活性吗？
本试剂盒不含有离子型去垢剂组份，不破坏蛋白的结构，没有对蛋白质之间原有的相互作用的破坏，蛋白均保持其天然构象和活性。
酵母线粒体膜蛋白丰度极低，在条件允许的情况下，需要尽可能加大酵母细胞的上样量。
处理部分组织样本时可能没有裂解完全，导致蛋白浓度低。只要适当延长试剂BCD的处理时间即可。最好在持续振荡的条件下处理，没有振荡器也可间隔几分钟用吸头吹打混匀。
2.用什么方法定量蛋白？
建议用BCA法。不适合用Bradford法，因为试剂E中含有干扰Bradford法的组份，导致定量不准。如果已经进行过透析处理或者用脱盐柱改换过缓冲体系，则可以用Bradford法定量。
3.提取的蛋白具有活性吗？
本试剂盒不含有离子型去垢剂组份，不破坏蛋白的结构，没有对蛋白质之间原有的相互作用的破坏，蛋白均保持其天然构象和活性。
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