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产品概述
product description
贝博® BBproExtra® 植物高尔基体膜蛋白提取试剂盒提供全套试剂，适用于从各种植物组织样本的高尔基体膜蛋白提取。提取过程简单方便，可在1小时内完成。提取的膜蛋白不仅纯度高，保持天然活性，而且绝少交叉污染。 本试剂盒含有的独特配方能够有效溶解膜组份。本试剂盒含有的蛋白酶抑制剂混合物，阻止了蛋白酶对蛋白的降解，为提取高纯度的蛋白提供了保证。 本试剂盒提取的蛋白可用于Western Blotting、蛋白质电泳、免疫沉淀、ELISA、酶活性测定等下游蛋白研究实验。 本试剂盒提取的蛋白为具有天然蛋白构象的活性蛋白。 本试剂盒中不含有EDTA，与金属螯和层析等下游应用兼容。
保存温度
2-8℃
注意事项
1.蛋白酶抑制剂未开盖使用前也可以2-8℃储存。开盖使用后-20℃储存。
2.蛋白酶抑制剂在2-8℃低温时是固体状态，从冰箱取出后恢复至室温或37℃短时间水浴，变成液体状态后离心至管底部再开盖。
3.试剂拆封后请尽快使用完！
2.蛋白酶抑制剂在2-8℃低温时是固体状态，从冰箱取出后恢复至室温或37℃短时间水浴，变成液体状态后离心至管底部再开盖。
3.试剂拆封后请尽快使用完！
有效期
一年
检测方法
WB,IP等
适用样本
植物
产品应用
WB,IP等
仪器准备
1.离心机
2.振荡器
3.涡旋混匀器
4.移液器
5.冰箱
6.冰盒
2.振荡器
3.涡旋混匀器
4.移液器
5.冰箱
6.冰盒
试剂准备
1.PBS缓冲液
2.蛋白定量试剂盒
2.蛋白定量试剂盒
耗材准备
1.离心管
2.吸头
3.一次性手套
2.吸头
3.一次性手套
使用注意事项
使用注意事项：
旋帽离心管装的试剂在开盖前请短暂离心，将盖内壁上的液体甩至管底，避免开盖时液体洒落。
实验过程中的所有试剂须预冷；所有器具须放-20℃冰箱预冷。整个过程须保持样品处于低温。
最好使用Dounce匀浆器匀浆，如果没有Dounce匀浆器，用普通玻璃匀浆器匀浆也可，但是蛋白回收率会下降。
提取液C在使用前须一直置于2-8℃条件，否则下游膜蛋白提取时会导致不容易分层。
膜蛋白电泳时loading buffer应该避免煮沸。
膜蛋白电泳时可以提高loading buffer的SDS含量。
离心机转速有相对离心力（RCF，×g）和每分钟转速（RPM，r/min）两种表示方式，有些离心机设置有RPM和×g显示切换，但部分离心机没有自动切换功能。需要用下面的公式进行换算：
g=r×1.118×10-5×rpm2 （r 为有效离心半径，即从离心机轴心到离心收集管底部中心位置的长度，单位为厘米) 例如: 转速为3000rpm，有效离心半径为10 cm，则相对离心力（RCF，×g）为=10×1.118×10-5×30002=1006.2（×g）。
旋帽离心管装的试剂在开盖前请短暂离心，将盖内壁上的液体甩至管底，避免开盖时液体洒落。
实验过程中的所有试剂须预冷；所有器具须放-20℃冰箱预冷。整个过程须保持样品处于低温。
最好使用Dounce匀浆器匀浆，如果没有Dounce匀浆器，用普通玻璃匀浆器匀浆也可，但是蛋白回收率会下降。
提取液C在使用前须一直置于2-8℃条件，否则下游膜蛋白提取时会导致不容易分层。
膜蛋白电泳时loading buffer应该避免煮沸。
膜蛋白电泳时可以提高loading buffer的SDS含量。
离心机转速有相对离心力（RCF，×g）和每分钟转速（RPM，r/min）两种表示方式，有些离心机设置有RPM和×g显示切换，但部分离心机没有自动切换功能。需要用下面的公式进行换算：
g=r×1.118×10-5×rpm2 （r 为有效离心半径，即从离心机轴心到离心收集管底部中心位置的长度，单位为厘米) 例如: 转速为3000rpm，有效离心半径为10 cm，则相对离心力（RCF，×g）为=10×1.118×10-5×30002=1006.2（×g）。
使用方法
1. 提取液准备：
每500 μl冷的蛋白提取液C中加入2 μl蛋白酶抑制剂混合物，混匀后置冰上备用。
2. 取100-200 mg新鲜植物叶片组织样本，用PBS洗涤干净。
3. 用剪刀尽可能剪碎，用冷PBS洗涤两次。
4. 加入1000 μl冷的试剂 A，置冰上10分钟。
5. 用匀浆机/匀浆器充分匀浆。
6. 匀浆液在4℃，1000×g力条件下离心5分钟。弃沉淀，收集上清。
7. 上清在4℃，3000×g力条件下离心10分钟。弃沉淀，将上清吸入另一预冷的干净离心管。
8. 将上清在4℃，6000×g力条件下离心10分钟。弃沉淀，收集上清。
9. 上清在4℃，50000×g力条件下离心20分钟。弃上清，留沉淀。
10. 在沉淀中加入500 μl冷的试剂B，混匀。
11. 在4℃，50000×g力条件下离心30分钟。弃上清，收集沉淀。
12. 在沉淀中加入400 μl蛋白提取液C，吹打混匀后，在4℃条件下振荡15-30分钟，至沉淀充分裂解，无明显沉淀。
13. 在4℃，12000×g条件下离心5分钟。
14. 将上清吸入另一干净离心管，在37℃水浴（气浴）15分钟。
15. 在37℃， 1000×g离心5分钟。此时溶液分为2层，下层是膜蛋白约为30-50 μl。
16. 小心移除上层，留下下层大约40 μl液体。
17. 用50-100 μl膜蛋白溶解液D溶解下层，即可得到高尔基体膜蛋白样品。
18. 将上述蛋白提取物定量后分装于-80℃冰箱保存备用或直接用于下游实验。
每500 μl冷的蛋白提取液C中加入2 μl蛋白酶抑制剂混合物，混匀后置冰上备用。
2. 取100-200 mg新鲜植物叶片组织样本，用PBS洗涤干净。
3. 用剪刀尽可能剪碎，用冷PBS洗涤两次。
4. 加入1000 μl冷的试剂 A，置冰上10分钟。
5. 用匀浆机/匀浆器充分匀浆。
6. 匀浆液在4℃，1000×g力条件下离心5分钟。弃沉淀，收集上清。
7. 上清在4℃，3000×g力条件下离心10分钟。弃沉淀，将上清吸入另一预冷的干净离心管。
8. 将上清在4℃，6000×g力条件下离心10分钟。弃沉淀，收集上清。
9. 上清在4℃，50000×g力条件下离心20分钟。弃上清，留沉淀。
10. 在沉淀中加入500 μl冷的试剂B，混匀。
11. 在4℃，50000×g力条件下离心30分钟。弃上清，收集沉淀。
12. 在沉淀中加入400 μl蛋白提取液C，吹打混匀后，在4℃条件下振荡15-30分钟，至沉淀充分裂解，无明显沉淀。
13. 在4℃，12000×g条件下离心5分钟。
14. 将上清吸入另一干净离心管，在37℃水浴（气浴）15分钟。
15. 在37℃， 1000×g离心5分钟。此时溶液分为2层，下层是膜蛋白约为30-50 μl。
16. 小心移除上层，留下下层大约40 μl液体。
17. 用50-100 μl膜蛋白溶解液D溶解下层，即可得到高尔基体膜蛋白样品。
18. 将上述蛋白提取物定量后分装于-80℃冰箱保存备用或直接用于下游实验。
常见问题分析
1.蛋白浓度低？
膜蛋白丰度比较低，在条件允许的情况下，需要尽可能加大组织样本上样量以提高膜蛋白浓度。
减少膜蛋白溶解液用量。
2.用什么方法定量蛋白？
建议用BCA法。不适合用Bradford法，因为试剂中含有干扰Bradford法的组份，导致定量不准。如果已经进行过透析处理或者用脱盐柱改换过缓冲体系，则可以用Bradford法定量。
3.提取的蛋白具有活性吗？
本试剂盒不含有离子型去垢剂组份，不破坏蛋白的结构，没有对蛋白质之间原有的相互作用的破坏，蛋白均保持其天然构象和活性。
4.膜蛋白电泳没有条带？
膜蛋白样品通常浓度较低，电泳前一定要进行蛋白定量，以保证电泳是蛋白上样量足够。
膜蛋白提取好后，用溶解液充分溶解后，可以超声处理一下，再进行蛋白定量。
蛋白加Loading buffer后可以不用煮沸，采用50℃保温30分钟。
蛋白Loading buffer中SDS终浓度含量可以提高至3%-10%。
有些样品的膜蛋白含量太低，可以使用丙酮沉淀膜蛋白，再使膜蛋白溶解于上样缓冲液中，一般可以跑出清晰的蛋白条带。
电泳时最好采用低电压低电流电泳。
膜蛋白丰度通常较低，有条件可以尝试用银染染色。
膜蛋白丰度比较低，在条件允许的情况下，需要尽可能加大组织样本上样量以提高膜蛋白浓度。
减少膜蛋白溶解液用量。
2.用什么方法定量蛋白？
建议用BCA法。不适合用Bradford法，因为试剂中含有干扰Bradford法的组份，导致定量不准。如果已经进行过透析处理或者用脱盐柱改换过缓冲体系，则可以用Bradford法定量。
3.提取的蛋白具有活性吗？
本试剂盒不含有离子型去垢剂组份，不破坏蛋白的结构，没有对蛋白质之间原有的相互作用的破坏，蛋白均保持其天然构象和活性。
4.膜蛋白电泳没有条带？
膜蛋白样品通常浓度较低，电泳前一定要进行蛋白定量，以保证电泳是蛋白上样量足够。
膜蛋白提取好后，用溶解液充分溶解后，可以超声处理一下，再进行蛋白定量。
蛋白加Loading buffer后可以不用煮沸，采用50℃保温30分钟。
蛋白Loading buffer中SDS终浓度含量可以提高至3%-10%。
有些样品的膜蛋白含量太低，可以使用丙酮沉淀膜蛋白，再使膜蛋白溶解于上样缓冲液中，一般可以跑出清晰的蛋白条带。
电泳时最好采用低电压低电流电泳。
膜蛋白丰度通常较低，有条件可以尝试用银染染色。
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