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产品概述
product description
贝博® BBproExtra® 线粒体蛋白/胞浆蛋白提取试剂盒提供全套试剂，适用于从各种原代或传代细胞和各种实体组织，如脑、脊髓、神经结或纤维、脂肪、肝脏、消化道、肾脏、心脏、肌肉、血管、结缔组织等哺乳动物组织中提取线粒体蛋白和胞浆蛋白。提取过程简单方便。制备的线粒体蛋白不仅纯度高，保持天然活性，而且绝少交叉污染。 本试剂盒含有的蛋白酶抑制剂混合物，阻止了蛋白酶对蛋白的降解，为提取高纯度的蛋白提供了保证。 本试剂盒提取的蛋白可用于Western Blotting、蛋白质电泳、免疫沉淀、ELISA、转录活性分析、Gel shift凝胶阻滞实验、酶活性测定等下游蛋白研究实验。 本试剂盒提取的蛋白为具有天然蛋白构象的活性蛋白。 本试剂盒中不含有EDTA，与金属螯和层析等下游应用兼容。
保存温度
2-8℃
注意事项
1.蛋白酶抑制剂未开盖使用前也可以2-8℃储存。开盖使用后-20℃储存。
2.蛋白酶抑制剂在2-8℃低温时是固体状态，从冰箱取出后恢复至室温或37℃短时间水浴，变成液体状态后离心至管底部再开盖。
3.试剂拆封后请尽快使用完！
2.蛋白酶抑制剂在2-8℃低温时是固体状态，从冰箱取出后恢复至室温或37℃短时间水浴，变成液体状态后离心至管底部再开盖。
3.试剂拆封后请尽快使用完！
有效期
一年
检测方法
WB,IP等
适用样本
动物组织
产品特点
1.使用方便。
2.含蛋白稳定剂，提取的蛋白稳定。
3.紫外检测蛋白浓度时，背景干扰低。
4.蛋白酶抑制剂抑制了蛋白的降解，蛋白酶抑制剂配方优化。蛋白酶抑制剂混合物包含6种独立的蛋白酶抑制剂；每一种抑制剂可特异性抑制某一种或几种蛋白酶活性。该混合物优化的组成使其可以抑制几乎所有重要的蛋白酶活性。
2.含蛋白稳定剂，提取的蛋白稳定。
3.紫外检测蛋白浓度时，背景干扰低。
4.蛋白酶抑制剂抑制了蛋白的降解，蛋白酶抑制剂配方优化。蛋白酶抑制剂混合物包含6种独立的蛋白酶抑制剂；每一种抑制剂可特异性抑制某一种或几种蛋白酶活性。该混合物优化的组成使其可以抑制几乎所有重要的蛋白酶活性。
产品应用
WB,IP等
仪器准备
1.离心机
2.振荡器
3.涡旋混匀器
4.移液器
5.冰箱
6.冰盒
2.振荡器
3.涡旋混匀器
4.移液器
5.冰箱
6.冰盒
试剂准备
1.PBS缓冲液
2.蛋白定量试剂盒
2.蛋白定量试剂盒
耗材准备
1.离心管
2.吸头
3.一次性手套
2.吸头
3.一次性手套
使用注意事项
使用注意事项：
旋帽离心管装的试剂在开盖前请短暂离心，将盖内壁上的液体甩至管底，避免开盖时液体洒落。
实验过程中的所有试剂须预冷；所有器具须放-20℃冰箱预冷。整个过程须保持样品处于低温。
蛋白酶抑制剂储存期间溶液如果出现沉淀，不影响使用，溶解后正常使用。
可以根据自己实验需要加入其它蛋白酶抑制剂单品。
最好使用标准Dounce匀浆器匀浆，如果没有标准Dounce匀浆器，用普通玻璃匀浆器匀浆也可，但是线粒体蛋白回收率将可能大幅下降。也可采用超声破碎的方法，建议功率30w，10s间隔10s。采用普通匀浆器或超声破碎，建议超声过程中镜检，保证细胞80%左右的破碎率，不能超声过度，否则可能会严重破坏线粒体，导致无法回收线粒体蛋白。
旋帽离心管装的试剂在开盖前请短暂离心，将盖内壁上的液体甩至管底，避免开盖时液体洒落。
实验过程中的所有试剂须预冷；所有器具须放-20℃冰箱预冷。整个过程须保持样品处于低温。
蛋白酶抑制剂储存期间溶液如果出现沉淀，不影响使用，溶解后正常使用。
可以根据自己实验需要加入其它蛋白酶抑制剂单品。
最好使用标准Dounce匀浆器匀浆，如果没有标准Dounce匀浆器，用普通玻璃匀浆器匀浆也可，但是线粒体蛋白回收率将可能大幅下降。也可采用超声破碎的方法，建议功率30w，10s间隔10s。采用普通匀浆器或超声破碎，建议超声过程中镜检，保证细胞80%左右的破碎率，不能超声过度，否则可能会严重破坏线粒体，导致无法回收线粒体蛋白。
使用方法
1. 试剂配制
根据样本数，每200 μl试剂C和试剂D中分别加入1 μl蛋白酶抑制剂混合物，充分混匀后置2-8℃备用。
2. 取50-100 mg新鲜组织样本，用冷PBS洗干净。
3. 加入300 μl冷的试剂 A，用Dounce匀浆器充分匀浆20-30下。
4. 然后在4℃，500×g条件下离心5分钟。弃沉淀，留上清。
5. 将上清在4℃，800×g条件下离心5分钟。弃沉淀，留上清。
6. 将上清在4℃，11000×g条件下离心15分钟。收集上清（I），收集沉淀（I）。
7. 将步骤8中的上清（I）吸入另一预冷的干净离心管，加入200 μl试剂C，充分混匀，在4℃振荡10分钟。
8. 在12000×g条件下离心5分钟，取上清，即得胞浆蛋白。
9. 在步骤6的沉淀（I）中加入200μl冷的试剂B，充分混匀。
10. 在4℃，11000×g条件下离心20分钟。弃上清，留沉淀。
11. 在沉淀中加入80 μl-150 μl试剂D，充分混匀，在4℃条件下振荡20-30分钟。
12. 在4℃，12000×g条件下离心15分钟。
13. 收集上清，即得线粒体蛋白。
14. 将上述蛋白提取物定量后分装于-80℃冰箱保存备用或直接用于下游实验。
根据样本数，每200 μl试剂C和试剂D中分别加入1 μl蛋白酶抑制剂混合物，充分混匀后置2-8℃备用。
2. 取50-100 mg新鲜组织样本，用冷PBS洗干净。
3. 加入300 μl冷的试剂 A，用Dounce匀浆器充分匀浆20-30下。
4. 然后在4℃，500×g条件下离心5分钟。弃沉淀，留上清。
5. 将上清在4℃，800×g条件下离心5分钟。弃沉淀，留上清。
6. 将上清在4℃，11000×g条件下离心15分钟。收集上清（I），收集沉淀（I）。
7. 将步骤8中的上清（I）吸入另一预冷的干净离心管，加入200 μl试剂C，充分混匀，在4℃振荡10分钟。
8. 在12000×g条件下离心5分钟，取上清，即得胞浆蛋白。
9. 在步骤6的沉淀（I）中加入200μl冷的试剂B，充分混匀。
10. 在4℃，11000×g条件下离心20分钟。弃上清，留沉淀。
11. 在沉淀中加入80 μl-150 μl试剂D，充分混匀，在4℃条件下振荡20-30分钟。
12. 在4℃，12000×g条件下离心15分钟。
13. 收集上清，即得线粒体蛋白。
14. 将上述蛋白提取物定量后分装于-80℃冰箱保存备用或直接用于下游实验。
常见问题分析
1.蛋白浓度低？
处理部分组织样本时可能没有裂解完全，导致蛋白浓度低。只要适当延长试剂的处理时间即可。最好在持续振荡的条件下处理，没有振荡器也可间隔几分钟用吸头吹打混匀。
2.用什么方法定量蛋白？
建议用BCA法。不适合用Bradford法，因为试剂中含有干扰Bradford法的组份，导致定量不准。如果已经进行过透析处理或者用脱盐柱改换过缓冲体系，则可以用Bradford法定量。
3.提取的蛋白具有活性吗？
本试剂盒不含有离子型去垢剂组份，不破坏蛋白的结构，没有对蛋白质之间原有的相互作用的破坏，蛋白均保持其天然构象和活性。
处理部分组织样本时可能没有裂解完全，导致蛋白浓度低。只要适当延长试剂的处理时间即可。最好在持续振荡的条件下处理，没有振荡器也可间隔几分钟用吸头吹打混匀。
2.用什么方法定量蛋白？
建议用BCA法。不适合用Bradford法，因为试剂中含有干扰Bradford法的组份，导致定量不准。如果已经进行过透析处理或者用脱盐柱改换过缓冲体系，则可以用Bradford法定量。
3.提取的蛋白具有活性吗？
本试剂盒不含有离子型去垢剂组份，不破坏蛋白的结构，没有对蛋白质之间原有的相互作用的破坏，蛋白均保持其天然构象和活性。
参考文献
1.Tao Li, Youtan Liu, Wei Xu, et al.
Polydatin mediates Parkin-dependent mitophagy and protects against mitochondria-dependent apoptosis in acute respiratory distress syndrome
Laboratory Investigation 2019
2.JieOuyang, ZhenhuaZeng et al.
SIRT3 Inactivation Promotes Acute Kidney Injury Through Elevated Acetylation of SOD2 and p53
Journal of Surgical Research 2019
3.Zhenhua Zeng, Zhongqing Chen, et al.
Polydatin Protecting Kidneys against Hemorrhagic Shock-Induced Mitochondrial Dysfunction via SIRT1 Activation and p53 Deacetylation
Oxidative Medicine and Cellular Longevity 2016
4.Wei Xiong, Shiyuan Xu, et al.
Moderate hypothermia ameliorates enterocyte mitochondrial dysfunction in severe shock and reperfusion
Journal of Surgical Research 2016
Polydatin mediates Parkin-dependent mitophagy and protects against mitochondria-dependent apoptosis in acute respiratory distress syndrome
Laboratory Investigation 2019
2.JieOuyang, ZhenhuaZeng et al.
SIRT3 Inactivation Promotes Acute Kidney Injury Through Elevated Acetylation of SOD2 and p53
Journal of Surgical Research 2019
3.Zhenhua Zeng, Zhongqing Chen, et al.
Polydatin Protecting Kidneys against Hemorrhagic Shock-Induced Mitochondrial Dysfunction via SIRT1 Activation and p53 Deacetylation
Oxidative Medicine and Cellular Longevity 2016
4.Wei Xiong, Shiyuan Xu, et al.
Moderate hypothermia ameliorates enterocyte mitochondrial dysfunction in severe shock and reperfusion
Journal of Surgical Research 2016
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