2-8℃

1.蛋白酶抑制剂未开盖使用前也可以2-8℃储存。开盖使用后-20℃储存。
2.蛋白酶抑制剂在2-8℃低温时是固体状态，从冰箱取出后恢复至室温或37℃短时间水浴，变成液体状态后离心至管底部再开盖。
3.试剂拆封后请尽快使用完！

一年

WB,IP等

动物细胞/组织

1.使用方便。
2.含蛋白稳定剂，提取的蛋白稳定。
3.紫外检测蛋白浓度时，背景干扰低。
4.蛋白酶抑制剂抑制了蛋白的降解，蛋白酶抑制剂配方优化。蛋白酶抑制剂混合物包含6种独立的蛋白酶抑制剂；每一种抑制剂可特异性抑制某一种或几种蛋白酶活性。该混合物优化的组成使其可以抑制几乎所有重要的蛋白酶活性。

WB,IP等

1.离心机
2.振荡器
3.涡旋混匀器
4.移液器
5.冰箱
6.冰盒

1.PBS缓冲液
2.蛋白定量试剂盒

1.离心管
2.吸头
3.一次性手套

使用注意事项：
 旋帽离心管装的试剂在开盖前请短暂离心，将盖内壁上的液体甩至管底，避免开盖时液体洒落。
 实验过程中的所有试剂须预冷；所有器具须放-20℃冰箱预冷。整个过程须保持样品处于低温。
 蛋白酶抑制剂储存期间溶液如果出现沉淀，不影响使用，溶解后正常使用。
 可以根据自己实验需要加入其它蛋白酶抑制剂单品。
 最好使用标准Dounce匀浆器匀浆，如果没有标准Dounce匀浆器，用普通玻璃匀浆器匀浆也可，但是线粒体蛋白回收率将可能大幅下降。也可采用超声破碎的方法，建议功率30w，10s间隔10s。采用普通匀浆器或超声破碎，建议超声过程中镜检，保证细胞80%左右的破碎率，不能超声过度，否则可能会严重破坏线粒体，导致无法回收线粒体蛋白。



细胞样本提取：
1. 试剂配制
根据样本数，每200ul试剂C和试剂D中分别加入1ul蛋白酶抑制剂混合物，充分混匀后置2-8℃备用。
2. 取1-2×107个细胞，在4℃，500×g条件下离心3分钟，小心吸取培养基，尽可能吸干，收集细胞。
3. 用冷PBS洗涤细胞两次，每次洗涤后尽可能吸干上清。
4. 加入200μl冷的试剂 A，置冰上5分钟。
5. 用Dounce匀浆器充分匀浆20-30下。
6. 然后在4℃，500×g条件下离心5分钟。弃沉淀，留上清。
7. 将上清在4℃，800×g条件下离心5分钟。弃沉淀，留上清。
8. 将上清在4℃，11000×g条件下离心15分钟。收集上清（I），收集沉淀（I）。
9. 将步骤8中的上清（I）吸入另一预冷的干净离心管，加入200ul试剂C，充分混匀，在4℃振荡10分钟。
10. 在12000×g条件下离心5分钟，取上清，即得胞浆蛋白。
11. 在步骤8的沉淀（I）中加入200μl冷的试剂B，充分混匀。
12. 在4℃，11000×g条件下离心20分钟。弃上清，留沉淀。
13. 在沉淀中加入80ul-150ul试剂D，充分混匀，在4℃条件下振荡20-30分钟。
14. 在4℃，12000×g条件下离心15分钟。
15. 收集上清，即得线粒体蛋白。
16. 将上述蛋白提取物定量后分装于-80℃冰箱保存备用或直接用于下游实验。

组织样本提取：
1. 试剂配制
根据样本数，每200ul试剂C和试剂D中分别加入1ul蛋白酶抑制剂混合物，充分混匀后置2-8℃备用。
2. 取50-100mg新鲜组织样本，用冷PBS洗干净。
3. 加入300μl冷的试剂 A，用Dounce匀浆器充分匀浆20-30下。
4. 然后在4℃，500×g条件下离心5分钟。弃沉淀，留上清。
5. 将上清在4℃，800×g条件下离心5分钟。弃沉淀，留上清。
6. 将上清在4℃，11000×g条件下离心15分钟。收集上清（I），收集沉淀（I）。
7. 将步骤8中的上清（I）吸入另一预冷的干净离心管，加入200ul试剂C，充分混匀，在4℃振荡10分钟。
8. 在12000×g条件下离心5分钟，取上清，即得胞浆蛋白。
9. 在步骤6的沉淀（I）中加入200μl冷的试剂B，充分混匀。
10. 在4℃，11000×g条件下离心20分钟。弃上清，留沉淀。
11. 在沉淀中加入80ul-150ul试剂D，充分混匀，在4℃条件下振荡20-30分钟。
12. 在4℃，12000×g条件下离心15分钟。
13. 收集上清，即得线粒体蛋白。
14. 将上述蛋白提取物定量后分装于-80℃冰箱保存备用或直接用于下游实验。

1.蛋白浓度低？
处理部分组织样本时可能没有裂解完全，导致蛋白浓度低。只要适当延长试剂D的处理时间即可。最好在持续振荡的条件下处理，没有振荡器也可间隔几分钟用吸头吹打混匀。
2.用什么方法定量蛋白？
建议用BCA法。不适合用Bradford法，因为试剂CD中含有干扰Bradford法的组份，导致定量不准。如果已经进行过透析处理或者用脱盐柱改换过缓冲体系，则可以用Bradford法定量。
3.提取的蛋白具有活性吗？
本试剂盒不含有离子型去垢剂组份，不破坏蛋白的结构，没有对蛋白质之间原有的相互作用的破坏，蛋白均保持其天然构象和活性。

1.Tao Li, Youtan Liu, Wei Xu, et al.
Polydatin mediates Parkin-dependent mitophagy and protects against mitochondria-dependent apoptosis in acute respiratory distress syndrome
Laboratory Investigation 2019 （IF=4.254）

2.JieOuyang, ZhenhuaZeng et al.
SIRT3 Inactivation Promotes Acute Kidney Injury Through Elevated Acetylation of SOD2 and p53
Journal of Surgical Research 2019 （IF=2.051）

3.Zhenhua Zeng, Zhongqing Chen, et al.
Polydatin Protecting Kidneys against Hemorrhagic Shock-Induced Mitochondrial Dysfunction via SIRT1 Activation and p53 Deacetylation
Oxidative Medicine and Cellular Longevity 2016 （IF=4.492）

4.Wei Xiong, Shiyuan Xu, et al.
Moderate hypothermia ameliorates enterocyte mitochondrial dysfunction in severe shock and reperfusion
Journal of Surgical Research 2016 （IF=2.198）