2-8℃

1.酵母内质网提取液B长期不用时-20℃保存。避免反复冻融。 2.酵母洗涤液D长期不用时-20℃保存。 3.蛋白酶抑制剂在2-8℃低温时是固体状态，从冰箱取出后恢复至室温或37℃短时间水浴，变成液体状态后离心至管底部再开盖。 4.试剂拆封后请尽快使用完！

一年

WB,IP等

酵母

WB,IP等

1.离心机2.振荡器3.匀浆机/匀浆器4.涡旋混匀器5.移液器6.冰箱7.冰盒

1.PBS缓冲液 （pH7.4，实验室常用的10mM磷酸缓冲盐溶液（1X）） （phosphate buffer saline/Dulbecco’s PBS：约含8mM Na2HPO4、2mM KH2PO4、137mM NaCl和3mM KCl）2.蛋白定量试剂盒

1.离心管2.吸头3.一次性手套

1.预实验很重要。必须要做预实验，在正式实验之前取少量样本优化实验条件，并像正式样本一样认真进行，看实验结果是否可行，实验条件是否适合自己的样本。由于生物样本的多样性，不同样本的实验条件通常差异较大，同种细胞的不同模型下需要的实验条件也可能不同，为了避免浪费正式样本和试剂，一定要提前预实验优化实验条件。 2.旋帽离心管装的试剂在开盖前请短暂离心，将盖内壁上的液体甩至管底，避免开盖时液体洒落。 3.实验过程中的所有试剂须预冷；所有器具须放-20℃冰箱预冷。整个过程须保持样品处于低温。 4.如果是做核酸类下游应用，实验中所有液体以及器具均应该用DEPC处理。用0.1%的DEPC处理12小时然后高压。 5.下游用于蛋白质类实验的话可以不用DEPC处理。 6.细胞最好采用新鲜收集的，或者收集后立即置于-80℃保存的样本。 7.最好使用标准Dounce匀浆器匀浆，如果没有标准Dounce匀浆器，用普通玻璃匀浆器匀浆也可，但是内质网回收率可能会下降。 8.离心机转速有相对离心力（RCF，×g）和每分钟转速（RPM，r/min）两种表示方式，有些离心机设置有RPM和×g显示切换，但部分离心机没有自动切换功能。需要用下面的公式进行换算：g=r×1.118×10-5×rpm2 （r 为有效离心半径，即从离心机轴心到离心收集管底部中心位置的长度，单位为厘米) 例如: 转速为3000 rpm，有效离心半径为10 cm，则相对离心力（RCF，×g）为=10×1.118×10-5×30002=1006.2（×g）。

1. 提取液准备：每100 μl冷的蛋白提取液F中加入1 μl蛋白酶抑制剂混合物，混匀后置冰上备用。【注】： 根据需要处理的样品数量准备蛋白提取液F，蛋白酶抑制剂混合物不可以一次全部加入提取液。 加过蛋白酶抑制剂的提取液一周内未使用完，再次使用前需要再次加入蛋白酶抑制剂。 蛋白样品用于测定某些细胞内蛋白酶、磷酸酶活性等下游实验时，注意根据实际情况调整抑制剂混合物是否加入。 以下步骤中使用的蛋白提取液为此步配制好的含蛋白酶抑制剂的提取液。2. 酵母培养物，在4℃，1000×g条件下离心5-10分钟，小心吸取培养基，尽可能吸干，收集酵母沉淀。3. 用PBS洗涤酵母两次，每次洗涤后尽可能吸干上清。【注】： 在1000×g离心5分钟。4. 每100 μl体积或100 mg湿重酵母沉淀物中加入400 μl酵母内质网提取液A，混匀后，在30℃条件下保温15分钟。【注】： 酵母数量根据实验情况调整，每次的裂解液用量并不是一定的，请根据实际情况调整。5. 在1000×g条件下离心5-10分钟，收集酵母沉淀。6. 用300 μl酵母洗涤液D重悬细胞，静置10分钟，离心收集酵母。7. 酵母沉淀物中加入500 μl酵母内质网提取液B，充分混匀。【注】： 根据酵母细胞量调整提取液用量，一般加菌体体积的2-5倍均可。 按酵母菌体体积每100 μl或100 mg湿重菌体加入250-500 μl提取液。8. 在37℃或室温条件下轻微振荡60-90分钟。【注】： 使用振荡器/摇床的较低转速，提取液能轻微晃动即可。 没有振荡条件也可以不振荡，稍微延长提取液的处理时间，中间每隔10分钟用移液器吹打混匀。 不同酵母样本需要的时间差异较大，根据下游细胞裂解的难易程度调整，如果下游试剂C处理后沉淀没有明显减少，需要延长此步骤处理时间。可以延长至2小时。9. 在2000×g条件下离心5-10分钟，弃上清，收集沉淀。10. 沉淀用300 μl酵母洗涤液D洗涤两次。离心收集沉淀。11. 在沉淀中加入400 μl酵母内质网提取液 C，充分混匀，用Dounce匀浆器匀浆20-30下。【注】： 标准Dounce匀浆器用紧杵5-8次，松杵匀浆15-20次。 匀浆杵一个上下来回为一次。 普通玻璃匀浆器匀浆一般也不超过30次，匀浆次数并非越多越好。 如果没有匀浆器，可以在加入试剂C以后在振荡器上振荡10-30分钟。用振荡器/摇床的较低转速，保持提取液有轻微晃动即可。没有振荡器的话，在4℃静置，稍微延长处理时间，中间每隔几分钟用移液器吹打混匀。 试剂C处理后沉淀应减少，否则振荡延长处理时间。12. 将匀浆液在4℃，1000×g力条件下离心5分钟。弃沉淀，收集上清。13. 将上清在4℃，3000×g力条件下离心10分钟，弃沉淀，收集上清。14. 将上清在4℃，12000×g -20000×g力条件下离心10分钟。弃沉淀，收集上清。。15. 在上清中加入100 μl试剂E，充分混匀。16. 置2-8℃冰箱静置过夜。【注】： 静置保存时间不少于10小时。17. 在4℃条件下，10000×g离心20-45分钟。18. 小心移除上清，收集沉淀。【注】： 尽可能吸干上清。 吸取时小心，防止吸掉沉淀。19. 沉淀中加入20-50 μl冷的蛋白提取液F，吹打混匀后，在4℃条件下振荡20-30分钟。【注】： 使用振荡器/摇床的较低转速，提取液能轻微晃动即可。 没有振荡条件也可以不振荡，稍微延长提取液的处理时间，中间每隔几分钟用移液器吹打混匀即可。20. 在4℃，10000×g条件下离心10分钟。21. 将上清吸入另一预冷的干净离心管，即可得到内质网蛋白。22. 将上述蛋白提取物定量后分装于-80℃冰箱保存备用或直接用于下游实验。【注】： 建议用BCA法进行蛋白定量。相关产品：BB-3401。 蛋白样品－80℃存放一年没有问题。注意不要被蛋白酶水解掉，不要被细菌污染。