2-8℃

1.蛋白酶抑制剂未开盖使用前也可以2-8℃储存。开盖使用后-20℃储存。
2.蛋白酶抑制剂在2-8℃低温时是固体状态，从冰箱取出后恢复至室温或37℃短时间水浴，变成液体状态后离心至管底部再开盖。
3.试剂拆封后请尽快使用完！

一年

WB,IP等

植物

 使用方便。  将蛋白提取的时间缩短至1小时。  含蛋白稳定剂，提取的蛋白稳定。  紫外检测蛋白浓度时，背景干扰低。  蛋白酶抑制剂抑制了蛋白的降解，蛋白酶抑制剂配方优化。蛋白酶抑制剂混合物包含6种独立的蛋白酶抑制剂；每一种抑制剂可特异性抑制某一种或几种蛋白酶活性。该混合物优化的组成使其可以抑制几乎所有重要的蛋白酶活性。

WB,IP等

1.离心机
2.振荡器
3.涡旋混匀器
4.移液器
5.冰箱
6.冰盒

1.PBS缓冲液
2.蛋白定量试剂盒

1.离心管
2.吸头
3.一次性手套

使用注意事项：
 旋帽离心管装的试剂在开盖前请短暂离心，将盖内壁上的液体甩至管底，避免开盖时液体洒落。
 蛋白酶抑制剂在2-8℃时是固体状态，从冰箱取出后恢复至室温或37℃短时间水浴，变成液体状态后离心至管底部再开盖。
 实验过程中的所有试剂须预冷；所有器具须放-20℃冰箱预冷。整个过程须保持样品处于低温。
 蛋白酶抑制剂储存期间溶液如果出现沉淀，不影响使用，溶解后正常使用。
 如果试剂盒不能短时间内用完，蛋白酶抑制剂混合物不可以一次全部加入提取液。
 可以根据自己实验需要加入其它蛋白酶抑制剂单品。


1． 提取液制备： 每300 μl冷的蛋白提取液B中加入2 μl蛋白酶抑制剂； 每300 μl冷的蛋白提取液D中加入2 μl蛋白酶抑制剂混合物，混匀后置冰上备用。 【注】：  根据需要处理的样品数量准备蛋白提取液，蛋白酶抑制剂混合物不可以一次全部加入提取液。  加过蛋白酶抑制剂的提取液一周内未使用完，再次使用前需要再次加入蛋白酶抑制剂。  以下步骤使用的蛋白提取液BD为此步骤添加了蛋白酶抑制剂的蛋白提取液。 2． 取洗净擦干后并去除叶梗和粗脉的200-500 mg植物组织样本用手术剪刀尽可能剪碎，加入1 ml 提取液A后用匀浆机充分匀浆或者用匀浆器充分匀浆。 【注】：  匀浆尽可能充分。至无明显可见固体。  培养细胞直接收集细胞后用匀浆器匀浆即可，匀浆后加提取液A混匀后直接进 行以下步骤离心。  处理叶片等组织样本如果没有匀浆机，也可先加少量提取液A后用Dounce匀浆器充分匀浆后再加提取液A混匀。 3． 将匀浆液用100 μm细胞筛过滤。 【注】：  没有细胞筛时可以不过滤，将匀浆液静置1分钟，待大的没有破碎的组织块自然沉降，吸取上清。  部分黏液较多的植物样本可能难以吸取，可以将1ml吸头的口剪掉一点再吸。 4． 将滤液在1000×g条件下离心10分钟，收集上清（I），收集沉淀（I）。 5． 在沉淀（I）中加入200-300 μl提取液B，充分混匀。 6． 置振荡器振荡30分钟。 【注】：  用振荡器/摇床的较低转速，保持液体有轻微晃动即可。  没有低温振荡条件可以不振荡，在2-8℃静置，稍微延长处理时间，中间每隔几分钟用移液器吹打混匀。 7． 在4℃，10000×g条件下离心10分钟。 8． 将上清吸入另一预冷的干净离心管，即可得到核蛋白。 9． 将上述蛋白提取物定量后分装于-80℃冰箱保存备用或直接用于下游实验。 10． 在第4步得到的上清（I）中加入10 μl提取液C，充分混匀。 【注】：  添加试剂C时注意有效的加入，由于试剂C比较粘稠，可能会吸附在吸头，没有添加进去，气温较低时可以把吸头和试剂C在37℃预热一下。  添加时不要将吸头伸入到冷的试剂A中，会导致试剂C凝固而出不来，在接近液面的地方沿着离心管壁加入，注意观察是否有效加入。  加入后充分混匀。 11． 在2-8℃振荡30-40分钟。 【注】：  此步骤必须在2-8℃条件。  使用较低转速保持提取液稍微晃动即可。  没有振荡条件可以不振荡，置2-8℃静置，稍微延迟处理时间，中间每隔几分钟用移液器吹打混匀。 12． 在37℃水浴10分钟。 13． 在37℃下 1000×g离心3分钟，此时溶液分为两层，上层是胞浆蛋白部分，下层部分（II）是膜蛋白约为40-50 μl。 【注】：  必需保证在37℃左右下离心，至少确保30℃以上。  无可控温的离心机时，也可不离心，延长37℃水浴时间至溶液变澄清，分层明显即可。 14． 将上层小心吸入另一预冷的干净离心管，即可得到胞浆蛋白。 15． 用50-100 μl冰冷的提取液D溶解步骤12中的下层部分（II），即得膜蛋白。 【注】：  膜蛋白比较难溶解，不能很快溶解混匀，可以在加入溶解液后稍微吹打混匀，然后置于4℃冰箱静置至溶解。中途用移液器轻轻吹打混匀一次。静置后取出再次用移液器稍微吹打混匀即可。  静置直至管底透明胶状物完全溶解。 16． 将上述蛋白提取物定量后分装于-80℃冰箱保存备用或直接用于下游实验。 【注】：  建议用BCA法进行蛋白定量。相关产品：BB-3401。  蛋白样品－80℃存放一年没有问题。注意不要被蛋白酶水解掉，不要被细菌污染。

 蛋白浓度低？ 植物核蛋白和膜蛋白丰度比较低，在条件允许的情况下，尽可能增加样本量。 处理部分样本时可能没有裂解完全，导致蛋白浓度低。只要适当增加试剂A的匀浆次数，并适当延长试剂B和C的处理时间即可。最好在持续振荡的条件下处理，没有振荡器也可间隔几分钟用吸头吹打混匀。  用什么方法定量蛋白？ 建议用BCA法。不适合用Bradford法，因为试剂A中含有干扰Bradford法的组份，导致定量不准。如果已经进行过透析处理或者用脱盐柱改换过缓冲体系，则可以用Bradford法定量。  提取时出现胶状沉淀？ 核蛋白提取液处理产物中有时会出现少量透明胶状物，属正常现象。该透明胶状物为含有基因组DNA等的复合物。不检测和基因组DNA结合特别紧密的特定蛋白的情况下，可以直接离心取上清进行后续实验即可；如果需要检测和基因组结合特别紧密的蛋白，则可以通过超声处理，300w/10秒间隔10秒，超声3分钟，随后离心取上清用于后续实验。  提取的蛋白具有活性吗？ 本试剂盒不含有离子型去垢剂组份，不破坏蛋白的结构，没有对蛋白质之间原有的相互作用的破坏，蛋白均保持其天然构象和活性。

 Yu Du et al. Phytophthora infestans RXLR effector PITG20303 targets a potato MKK1 protein to suppress plant immunity New Phytologist 2020 （IF=8.512）  Li Sun et al. Endogenous ABA alleviates rice ammonium toxicity by reducing ROS and free ammonium via regulation of the SAPK9–bZIP20 pathway Journal of Experimental Botany 2020 （IF=5.36）  Binhui Zhan et al. Functional Scanning of Apple Geminivirus Proteins as Symptom Determinants and Suppressors of Posttranscriptional Gene Silencing Viruses. 2018 （IF=3.761）